מודל לטיפול באנצפלומיוסיננגיוזיס לאחר שבץ מוחי הנגרם על ידי חסימת עורקים מוחיים באמצע בעכברים
Summary
הפרוטוקול נועד לספק שיטות לאנצפלומיוסיננגיוזיס – השתלה של דש שריר טמפורליס וסקולרי על פני השטח של רקמת מוח איסכמית – לטיפול בשבץ איסכמי שאינו מויאמויה. יעילות הגישה בהגברת אנגיוגנזה מוערכת באמצעות מודל חסימה חולף של עורק מוחי אמצעי בעכברים.
Abstract
אין טיפול יעיל זמין עבור רוב החולים הסובלים משבץ איסכמי, מה שהופך את הפיתוח של טיפולים חדשניים הכרחי. יכולתו של המוח לרפא את עצמו לאחר שבץ איסכמי מוגבלת על ידי אספקת דם לא מספקת באזור הפגוע. אנצפלומיוסיננגיוזיס (EMS) הוא הליך נוירוכירורגי המשיג אנגיוגנזה בחולים עם מחלת מויאמויה. זה כרוך craniotomy עם מיקום של שתל שריר temporalis כלי הדם על פני השטח של המוח איסכמי. EMS מעולם לא נחקר במסגרת שבץ איסכמי חריף בעכברים. ההשערה המניעה את המחקר היא ש-EMS משפר את האנגיוגנזה המוחית במשטח קליפת המוח המקיף את שתל השריר. הפרוטוקול המוצג כאן מתאר את ההליך ומספק נתונים ראשוניים התומכים בהיתכנות וביעילות של גישת EMS. בפרוטוקול זה, לאחר 60 דקות של חסימת עורק מוחי אמצעי חולף (MCAo), עכברים שובצו באקראי לטיפול MCAo או MCAo + EMS. ה- EMS בוצע 3-4 שעות לאחר החסימה. העכברים הוקרבו 7 או 21 יום לאחר טיפול MCAo או MCAo + EMS. כדאיות השתל הטמפורליס נמדדה באמצעות בדיקת ניקוטינאמיד אדנין דינוקלאוטיד מופחת-טטרזוליום רדוקטאז. מערך אנגיוגנזה של עכבר כימת ביטוי חלבונים אנגיוגניים ונוירומודולטוריים. אימונוהיסטוכימיה שימשה להדמיה של קשר שתלים עם קליפת המוח ושינוי בצפיפות כלי הדם. הנתונים הראשוניים כאן מצביעים על כך ששריר מושתל נשאר בר קיימא 21 יום לאחר EMS. אימונוסטינינג הראה השתלה מוצלחת ועלייה בצפיפות כלי הדם ליד השתלת השריר, מה שמעיד על אנגיוגנזה מוגברת. הנתונים מראים כי EMS מגביר את גורם הגדילה של פיברובלסטים (FGF) ומוריד את רמות האוסטאופונטין לאחר שבץ מוחי. בנוסף, EMS לאחר שבץ לא העלה את התמותה מה שמרמז על כך שהפרוטוקול בטוח ואמין. הליך חדשני זה יעיל ונסבל היטב ויש לו פוטנציאל לספק מידע על התערבויות חדשניות לאנגיוגנזה משופרת לאחר שבץ איסכמי חריף.
Introduction
שבץ איסכמי הוא פגיעה נוירו-וסקולרית חריפה עם sequelae כרונית הרסנית. רוב הסובלים משבץ מוחי, 650,000 בשנה, בארה”ב סובלים מנכות תפקודית קבועה1. אף אחד מהטיפולים הזמינים אינו מעניק הגנה עצבית והתאוששות תפקודית לאחר השלב החריף של שבץ איסכמי. לאחר שבץ איסכמי חריף, אספקת הדם הישירה והבטוחה פוחתת, מה שמוביל לתפקוד לקוי של תאי המוח והרשתות, וכתוצאה מכך לליקויים נוירולוגיים פתאומיים 2,3. שיקום אספקת הדם לאזור האיסכמי נותר המטרה הראשונה במעלה של טיפול בשבץ מוחי. לפיכך, שיפור אנגיוגנזה כדי לקדם את אספקת הדם בשטח איסכמי היא גישה טיפולית מבטיחה; עם זאת, שיטות שנחקרו בעבר לקידום אנגיוגנזה לאחר שבץ, כולל אריתרופואיטין, סטטינים וגורמי גדילה, הוגבלו על ידי רמות בלתי מתקבלות על הדעת של רעילות או תרגום4.
אנצפלומיוסיננגיוזיס (EMS) הוא הליך כירורגי המשפר אנגיוגנזה מוחית בבני אדם עם מחלת moyamoya, מצב של עורקי גולגולת צרים שלעתים קרובות מוביל לשבץ. EMS כולל ניתוק חלקי של קטע כלי הדם של שריר הטמפורליס של המטופל מהגולגולת, ולאחר מכן קרניוטומיה והשתלה של השריר על קליפת המוח הפגועה. הליך זה נסבל היטב ומשרה אנגיוגנזה מוחית, הפחתת הסיכון לשבץ איסכמי בחולים עם מחלת moyamoya 5,6. לפיכך, ההליך משמש במידה רבה תפקיד מניעתי בחולים אלה. לאנגיוגנזה שנגרמת על ידי הליך זה עשוי להיות גם תפקיד בקידום הגנה נוירו-וסקולרית והתאוששות בסביבה של שבץ איסכמי. דו”ח זה תומך בהשערה כי אנגיוגנזה שנוצרה על ידי EMS יש פוטנציאל להרחיב את ההבנה ואת האפשרויות הטיפוליות עבור איסכמיה מוחית.
לצד EMS, ישנן מספר גישות פרמקולוגיות וכירורגיות לשיפור אנגיוגנזה, אך יש להן מספר מגבלות. גישות פרמקולוגיות כגון מתן פקטור גדילה אנדותל וסקולרי (VEGF) נמצאו כבלתי מספקות או אפילו מזיקות בשל מספר מגבלות, כולל היווצרות של פלקסוסים כאוטיים, לא מאורגנים, דולפים ופרימיטיביים של כלי הדם, הדומים לאלה שנמצאו ברקמות הגידול 7,8 ואין להם השפעות מועילות בניסויים קליניים9.
גישות כירורגיות כוללות אנסטומוזיס ישיר כגון אנסטומוזיס עורק רקיע-עורקי מוח אמצעי-שטחי שטחי, אנסטומוזיס עקיף כגון אנצפלו-דורו עורקי-סיננגיוזיס (EDAS), אנצפלומיוסיננגיוזיס (EMS), ושילובים של אנסטומוזיס ישיר ועקיף10. כל ההליכים הללו מאתגרים מאוד מבחינה טכנית ותובעניים בבעלי חיים קטנים, למעט EMS. בעוד שההליכים האחרים דורשים אנסטומוזיס וסקולרי מורכב, EMS דורש השתלת שריר פשוטה יחסית. יתר על כן, הקרבה של שריר temporalis לקליפת המוח עושה את זה בחירה טבעית עבור השתלה, כפי שהוא לא צריך להיות נכרת לחלוטין או מנותק מאספקת הדם שלה, כפי שיהיה צורך אם שריר מרוחק יותר שימשו להשתלה.
EMS נחקר במודלים של היפופרפוזיה מוחית כרונית בחולדות 7,11. עם זאת, EMS באמצעות שתל שריר טמפורליס מעולם לא נחקר בשבץ איסכמי חריף במכרסמים. כאן אנו מתארים פרוטוקול חדש של EMS בעכברים לאחר שבץ איסכמי באמצעות מודל חסימת עורק המוח האמצעי (MCAo). כתב יד זה משמש כתיאור של שיטות ונתונים מוקדמים עבור גישה חדשנית זו של EMS בעכברים לאחר MCAo.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר הליך EMS מוצלח במודל עכבר של שבץ מוחי המושרה על-ידי MCAo. הנתונים מראים כי רקמה מושתלת נשארת בת קיימא ויכולה ליצור קשרים עם קליפת המוח זמן רב לאחר ניתוח EMS. ממצאים אלה תומכים ברציונל של שימוש בשתל שריר מוחי כדי לפתח בהדרגה סביבה טרופית עשירה בכלי הדם במקום של שבץ. EMS הוא טיפול מב?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית מצוינות מחקרית – UConn Health (לקטאן ר בולסארה וראג’קומאר ורמה) וסטארט-אפ הבריאות UConn (לראג’קומאר ורמה).
Materials
| 6-0 monocryl suture | Ethilon | 697G | |
| 70% ethanol to sanitize operating surface | Walgreen | ||
| Bupivacaine 0.25% solution | Midwest Vet | ||
| Clamps for tissue retraction | Roboz | ||
| Doccal suture with Nylon coating | Doccal corporation Sharon MA | 602145PK10Re | |
| Electric heating pad for operating surface | |||
| Isoflurane anesthesia | Piramal Critical Care Inc | ||
| Isoflurane delivery apparatus | –B6Surgivet (Isotech 4) | ||
| Micro drill | Harvard Apparatus | ||
| Microdissecting tweezers, curved x2 | Piramal Critical Care Inc | ||
| mouse angiogenesis panel arrat | R& D biotech | ARY015 | |
| Needle driver | Ethilon | ||
| Ointment for eye protection | walgreen | ||
| Operating microscope | Olympus | ||
| Operating surface | Olympus | ||
| Povidone iodine solution | walgreen | ||
| Rectal thermometer | world precison instrument | ||
| Saline or 70% ethanol for irrigation | walgreen | ||
| Small electric razor to shave operative site | generic | ||
| Surgical scissors | Roboz |
References
- Stroke, Last updated 10/22/20. , (2020).
- Cipolla, M. J., McCall, A. L., Lessov, N., Porter, J. M. Reperfusion decreases myogenic reactivity and alters middle cerebral artery function after focal cerebral ischemia in rats. Stroke. 28 (1), 176-180 (1997).
- Arai, K., et al. Cellular mechanisms of neurovascular damage and repair after stroke. Journal of Child Neurology. 26 (9), 1193-1198 (2011).
- Ergul, A., Alhusban, A., Fagan, S. C. Angiogenesis: a harmonized target for recovery after stroke. Stroke. 43 (8), 2270-2274 (2012).
- Imai, H., et al. The importance of encephalo-myo-synangiosis in surgical revascularization strategies for moyamoya disease in children and adults. World Neurosurgery. 83 (5), 691-699 (2015).
- Ravindran, K., Wellons, J. C., Dewan, M. C. Surgical outcomes for pediatric moyamoya: a systematic review and meta-analysis. Journal of Neurosurgery: Pediatrics. 24 (6), 663-672 (2019).
- Kim, H. S., et al. The neovascularization effect of bone marrow stromal cells in temporal muscle after encephalomyosynangiosis in chronic cerebral ischemic rats. Journal of Korean Neurosurgical Society. 44 (4), 249-255 (2008).
- Srivastava, P., et al. Neuroprotective and neuro-rehabilitative effects of acute purinergic receptor P2X4 (P2X4R) blockade after ischemic stroke. Experimental Neurology. , 329 (2020).
- Cao, R., et al. VEGFR1-mediated pericyte ablation links VEGF and PlGF to cancer-associated retinopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (2), 856-861 (2010).
- Hedlund, E., Hosaka, K., Zhong, Z., Cao, R., Cao, Y. Malignant cell-derived PlGF promotes normalization and remodeling of the tumor vasculature. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17505-17510 (2009).
- Cao, Y. Therapeutic angiogenesis for ischemic disorders: what is missing for clinical benefits. Discovery Medicine. 9 (46), 179-184 (2010).
- Verma, R., et al. Inhibition of miR-141-3p ameliorates the negative effects of poststroke social isolation in aged mice. Stroke. 49 (7), 1701-1707 (2018).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. Modeling stroke in mice-middle cerebral artery occlusion with the filament model. Journal of Visualized Experiments. 47 (47), 2423 (2011).
- Pétrault, M., et al. Neither nefopam nor acetaminophen can be used as postoperative analgesics in a rat model of ischemic stroke. Fundam Clin Pharmacol. (2), 194-200 (2017).
- Khansari PS, ., Halliwell RF, . Mechanisms Underlying Neuroprotection by the NSAID Mefenamic Acid in an Experimental Model of Stroke. (64), (2019).
- Mishra, V., Verma, R., Raghubir, R. Neuroprotective effect of flurbiprofen in focal cerebral ischemia: the possible role of ASIC1a. Neuropharmacology. 59 (7-8), 582-588 (2010).
- Chen, T. Y., Goyagi, T., Toung, T. J., Kirsch, J. R., Hurn, P. D., Koehler, R. C., Bhardwaj, A. Prolonged opportunity for ischemic neuroprotection with selective kappa-opioid receptor agonist in rats. Stroke. 35 (5), 1180-1185 (2004).
- Turóczi, Z., et al. Muscle fiber viability, a novel method for the fast detection of ischemic muscle injury in rats. PLoS ONE. 9 (1), e84783 (2014).
- Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. An introduction to performing immunofluorescence staining. Methods in Molecular Biology. , 299-311 (2019).
- Zheng, J., et al. Protective roles of adenosine A1, A2A, and A3 receptors in skeletal muscle ischemia and reperfusion injury. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 293 (6), H3685-H3691 (2007).
- Jiao, C., et al. Visualization of mouse choroidal and retinal vasculature using fluorescent tomato lectin perfusion. Translational Vision Science and Technology. 9 (1), (2020).
- Simard, J. M., Sahuquillo, J., Sheth, K. N., Kahle, K. T., Walcott, B. P. Managing malignant cerebral infarction. Current Treatment Options in Neurology. 13 (2), 217-229 (2011).
- Liu, X., et al. Osteoclasts protect bone blood vessels against senescence through the angiogenin/plexin-B2 axis. Nature Communications. 12 (1), 1832 (2021).
- Paro, M., Gamiotea-Turro, D., Blumenfeld, L., Bulsara KR, ., Verma, R. A Novel Model for Encephalomyosynangiosis Surgery after Middle Cerebral Artery Occlusion-Induced Stroke in Mice. BioXriv. 10, (2021).
- Venkat, P., et al. Treatment with an Angiopoietin-1 mimetic peptide promotes neurological recovery after stroke in diabetic rats. CNS Neuroscience & Therapeutics. 27 (1), 48-59 (2021).
- Cheng, X., et al. Acidic fibroblast growth factor delivered intranasally induces neurogenesis and angiogenesis in rats after ischemic stroke. Neurological Research. 33 (7), 675-680 (2011).
- Xu, H. Protective effects of mutant of acidic fibroblast growth factor against cerebral ischaemia-reperfusion injury in rats. Injury. 40 (9), 963-967 (2009).
- Tsai, M. J., et al. Acidic FGF promotes neurite outgrowth of cortical neurons and improves neuroprotective effect in a cerebral ischemic rat model. 신경과학. 305, 238-247 (2015).
- Meller, R., et al. Neuroprotection by osteopontin in stroke. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 25 (2), 217-225 (2005).
- Meseguer, E., et al. Osteopontin predicts three-month outcome in stroke patients treated by reperfusion therapies. Journal of Clinical Medicine. 9 (12), 4028 (2020).
- Zhu, Z., et al. Plasma osteopontin levels and adverse clinical outcomes after ischemic stroke. Atherosclerosis. 332, 33-40 (2021).
