Denne artikel præsenterer en protokol til dannelse af mikrotubulussamlinger i form af taktoider ved hjælp af MAP65, en plantebaseret mikrotubuluskrydsbinding og PEG som trængselsmiddel.
Cytoskelettet er ansvarlig for større intern organisation og omorganisering i cellen, alt sammen uden en leder til at lede ændringerne. Dette er især tilfældet under mitose eller meiose, hvor mikrotubuli danner spindlen under celledeling. Spindlen er det maskineri, der bruges til at adskille genetisk materiale under celledeling. Mod at skabe selvorganiserede spindler in vitro udviklede vi for nylig en teknik til at rekonstituere mikrotubuli i spindellignende samlinger med et minimalt sæt mikrotubulusassocierede proteiner og trængselsmidler. Specifikt blev MAP65 anvendt, som er en antiparallel mikrotubulus tværbinding fra planter, en homolog af Ase1 fra gær og PRC1 fra pattedyrorganismer. Denne tværbinding organiserer selv mikrotubuli i lange, tynde, spindellignende mikrotubulus selvorganiserede samlinger. Disse samlinger ligner også flydende krystal tactoider, og mikrotubuli kan anvendes som mesoskala mesogener. Her præsenteres protokoller til oprettelse af disse mikrotubulus tactoider samt til karakterisering af samlingernes form ved hjælp af fluorescensmikroskopi og mobiliteten af bestanddelene ved hjælp af fluorescensgendannelse efter fotobleaching.
Celledeling via mitose er en af de vigtigste biologiske processer for at opretholde livet. Mikrotubulusfilamenterne, der består af tubulindimere, er væsentlige strukturelle elementer i denne proces. Det forbigående maskineri, der skabes i metafase, når kromosomerne justeres i cellecentret, kaldes den mitotiske spindel på grund af dens form, som er som en spindel af en væv dækket af tråde (figur 1A). Det er veletableret på tværs af mange organismer, at mikrotubuli bruges i metafase til at skubbe og trække kondenserede kromosomer ind i midten af cellen, justere dem og tilslutte dem til mikrotubuli, der vil trække dem fra hinanden i anafase (figur 1B, C). Spindlen dannes i både meiose (figur 1B) og mitose (figur 1C), skabt af mange overlappende mikrotubuli, der ikke er viklet rundt om den centrale akse som tråd, men løber parallelt med grænsefladen. Oprettelse af disse mikrotubulusbaserede strukturer kræver tilknyttede proteiner, der tværbinding og tilhørende enzymer, der kan fungere som motorer til at hjælpe med at skubbe og trække kromosomerne1.
Undersøgelser af meiotiske spindler har vist, at mikrotubuli er korte, dynamiske og overlappende i tværbundne arrays 2,3,4,5,6 (figur 1Di). På grund af den fysiske organisering af disse korte mikrotubuli ligner den meiotiske spindel en flydende krystal taktoid (figur 1E). Faktisk har spindler vist sig at samle sig og fusionere, som man ville forvente af flydende krystal tactoider5.
Mange undersøgelser, der går tilbage til 1960’erne, har brugt fiksering, serielle sektioner og elektronmikroskopi for at bestemme, at der er to typer mikrotubuli inde i den mitotiske spindel 7,8,9,10. Den første type kaldes kinetochore mikrotubuli, som forbinder spindelstangen til kinetochore. Den anden type kaldes de interpolære eller polære mikrotubuli, som vokser forbi kromosomerne og overlapper ved midtzonen (figur 1Dii)8,9,10. En tredje type kaldes de astrale mikrotubuli, som er uden for spindlen og forbinder polerne til cellekanten; disse mikrotubuliorganisationer er uden for rammerne af den aktuelle diskussion. Der har været nylige undersøgelser af interaktionen mellem augmin6 og gamma-tubulin ringkompleks, der påvirker kimdannelsescentre for mikrotubuli, hvilket resulterer i en mitotisk spindel med kortere mikrotubuli som i figur 1D.
Da mikrotubuli er længere, end de er brede, med et højt billedformat og høj stivhed, er de som opskalerede versioner af flydende krystalmolekyler. I blødstoffysik er atomer og molekyler blevet tilnærmet ved hjælp af minimale interaktioner for at udlede de fysiske mekanismer for faseovergange, herunder kimdannelse og smeltning af krystaller11. På samme måde er mikrotubuli mesoskalaobjekter, der er opskalerede versioner af flydende krystalmolekyler, hvilket giver indsigt i fysikken i flydende krystaldynamik, herunder kimdannelse og vækst af de nematiske faser fra isotropiske. Som diskuteret ovenfor viser den meiotiske spindel egenskaber som dem af en flydende krystal taktoid, en nematisk tilstand, der nukleerer og vokser fra den isotropiske tilstand af flydende krystalmolekyler 3,4,5. For taktoider er kimdannelse og vækst som for andre krystaller (dvs. kræver en relativt høj koncentration af mesogener [molekylerne, der danner flydende krystaller]). Den unikke “spindel” form af tactoid kommer fra den lokale justering af de flydende krystal mesogener, der justerer ind i den nematiske fase (figur 1E). De kan ikke danne en afrundet krystal, fordi molekylerne er meget asymmetriske. I betragtning af mikrotubuliens art er det måske ikke overraskende, at det mitotiske spindelmaskineri fremstillet af en høj lokal koncentration af mikrotubuli også har samme form, hvad enten det kaldes en taktoid eller spindel. Tactoider kan være bipolære med poler i de koniske ender (figur 1Ei) eller homogene, med poler effektivt i uendelig (figur 1Eii).
I betragtning af betydningen af spindeldannelse har der været bestræbelser i gang mod selvorganiseret spindeldannelse in vitro ved at demonstrere mikrotubuluskondensation i bundter via ioniske arter12,13, trængselsmidler, der skaber udtømningsinteraktioner 14,15, og specifikke mikrotubulus tværbindende proteiner 13,16,17,18,19, 21. Overraskende nok, selvom disse midler alle arbejder for at øge den lokale koncentration af mikrotubuli, resulterer de ofte i lange mikrotubulusbundter, men ikke taktoider. En af grundene til, at disse bundter er lange, kan være, at mikrotubuli, der omfatter dem, også er lange. Nyligt arbejde ved hjælp af kortere mikrotubuli rapporterede også længere bundter, der ikke er tilspidset i slutningenaf 15; i dette tilfælde holdes bundterne sammen med motorproteiner, der forårsager forlængelse af bundterne og derved gør dem længere. Korte mikrotubuli med ikke-ekstensile tværbindinger er nødvendige til koniske, spindellignende samlinger, som beskrevet her.
For nylig har vi udviklet en teknik til at muliggøre dannelsen af mikrotubulus tactoider ved hjælp af antiparallel tværbinding, MAP65, i nærværelse af nucleating stabile mikrotubuli22. Mikrotubuli skulle være korte, men få kendte regulatorer af mikrotubuluslængde kan dække mikrotubuli mod dynamisk ustabilitet eller ende-til-ende-udglødning. I stedet blev GMPCPP brugt til at nukleere og stabilisere filamenterne efter vækst. Dette gjorde det muligt at skabe en høj tæthed af korte mikrotubuli, der kunne selvorganisere sig i taktarter. Disse taktoider var homogene, når de blev set under birefringence. Ud over korte mikrotubuli blev en specifik antiparallel tværbinding, MAP65, anvendt til at danne taktoiderne (figur 2). MAP65 er et plantemikrotubulus-associeret protein i PRC1/Ase1-familien af mitotiske tværbindinger23. MAP65 eksisterer som en dimer, med en stærk affinitet til at binde sig til sig selv såvel som mikrotubuli24. I modsætning til den meiotiske spindel og taktoider, der observeres med actinfilamenter 25,26,27, som er bipolære og har flydende egenskaber som flydende krystaller, er mikrotubulus tactoider blevet observeret at være fastlignende 22,28.
Her præsenteres protokoller til oprettelse af mikrotubulus tactoider og karakterisering af samlingernes form og bestanddelenes mobilitet ved hjælp af fluorescensbaserede teknikker.
De metoder, der er beskrevet her, er blevet brugt i flere papirer til at skabe mikrotubulus tactoider (figur 2)22,28. Disse eksperimenter er biologisk relevante for at hjælpe med at afdække de organisatoriske principper, der styrer formen og stabiliteten af den mitotiske eller meiotiske spindel i de fleste celletyper. Derudover er mikrotubuli model flydende krystal mesogener, der kan hjælpe med at lære mere om, hvordan flydende krystaller nukleerer og vokser nematiske faser fra isotropiske faser.
Proceduren skitseret her har flere fordele ved at udforske mikrotubuli selvorganisering. For det første er det meget reproducerbart, idet det er blevet udført i laboratoriet af mange studerende, herunder gymnasieelever, med lidt forudviden eller træning, før de starter i laboratoriet. Tactoider er birefringent22, så de kan ses i transmitteret lys ud over fluorescensmikroskopi, hvilket gør denne metode tilgængelig for mange laboratorier og denne eksperimentelle procedure, der kan tilpasses uddannelsesmæssige formål ud over avanceret forskning. Endelig åbner denne proces muligheder for at fortsætte med at forstå og undersøge biologiske systemer i en fjernet, reduktionistisk tilgang, der gør det muligt for en at forstå, hvordan hver yderligere tilstand, protein eller additiv kan ændre selvorganiseringen af tactoider og måske i sidste ende spindlen. Mål for bedre biomimicry inkluderer aktivitet, fluiditet og filamentpolaritetssortering.
Der kan være flere faktorer, der påvirker eksperimentet, hvilket giver uventede resultater. Hvis tactoider f.eks. ikke dannes (figur 2), men der observeres viftelignende mønstre, er MAP65 sandsynligvis ikke til stede eller ikke bindende for mikrotubuli22,28. Dette burde også være indlysende i MAP65-fluorescenskanalen, fordi GFP-MAP65 ikke vil være bundet til mikrotubuli.
Hvis taktoiderne ikke dannes, og baggrunden vises som pletter på glasset, kan dette skyldes overfladebelægningen. Når den er udført, varer silaniseringen kun 1 måned på dækslips. Når det slides af, vil tubulinet være i stand til at binde sig til den udsatte overflade ikke-specifikt. Denne binding vil forekomme i ulige mønstre.
Hvis taktoiderne ikke dannes, og tubulinet observeres i aggregater af forskellige former og størrelser, kan dette skyldes tubulin af dårlig kvalitet. Tubulin kan centrifugeres for at fjerne indledende aggregater, der kan drive denne off-pathway aggregering i stedet for mikrotubuluspolymerisation. Hvis overfladen binder sig til tubulinet, kan det også nedbryde tubulinet i opløsningen. Lave koncentrationer af tubulin, under den kritiske koncentration for polymeriserende mikrotubuli, kan resultere i aggregater.
I FRAP-eksperimenter, hvis MAP65-kanalen ikke viser nogen genopretning (figur 5), er det muligt, at fotobleaching var fotodamaging mikrotubuli. Photodamage forårsager lokaliseret ødelæggelse af filamenterne. Dette kan kontrolleres ved undersøgelse i den transmitterede kanal. Mikrotubulus tactoider er synlige i den transmitterede kanal gennem et højt indeks for brydningsmismatch med det omgivende vand. Lysinduceret fotoskade vises som et brændemærke eller tab af kontrast i transmitteret lysbilleddannelse på det sted, hvor ROI udsættes for fotobleaching. Hvis dette sker, skal laser- eller lyseffekten reduceres for at hæmme proteinernes fotoskade.
Der var flere udfordringer i denne procedure og tilgang. Et problem er, at længdemålene i øjeblikket udføres manuelt ved at klikke på billedet. Denne metode, selvom den er ligetil, kan resultere i stor usikkerhed. Breddemålingen, der bruger tværsnittet og monteringen til en gaussisk, er en bedre metode til kvantificering af størrelsen. En lignende metode kunne anvendes i længden. Et andet problem er, at taktoiderne nogle gange kan bøje sig, fordi de er så lange og tynde. Dette gør det vanskeligere at kvantificere længden. Konturlængden kan kvantificeres ved hjælp af en segmenteret linje, men der tilføjes usikkerhed, hver gang et segment tilføjes.
Fra et videnskabeligt perspektiv har denne tilgang nogle andre udfordringer for dens anvendelse som model for flydende krystaller eller spindler. Den første udfordring har været den lange, tynde form af de taktoider, som mikrotubuli skaber (figur 3 og figur 4). Som nævnt i tidligere publikationer22 er mikrotubulus tactoider homogene taktoider, ikke bipolære. Det betyder, at mikrotubuli, der udgør formen, ikke omorienterer sig for at pege mod strukturens spidser. I stedet er alle mikrotubuli parallelle med den lange akse, og “polerne” er placeret i uendelighed. Dette er meget forskelligt fra de taktoider, der observeres for molekylære flydende krystaller eller endda for actin eller DNA, der også kan fungere som flydende krystal mesogener. I disse andre systemer er taktoiderne bipolære, og når de ses i krydsede polarisatorer, viser de de afslørende tegn på omorientering af stængerne.
En anden stor udfordring i dette system er, at mikrotubuli er ubevægelige inde i taktoidet. Dette fremgår klart af FRAP-eksperimenter og analyser, da genopretningen af mikrotubuli er meget lav. Deres faste karakter gør mikrotubulus tactoider mindre værdifulde som store flydende krystalanaloger. Den nematiske fase af en flydende krystal skal have både flydende (væske) og krystal (organiserede) egenskaber. Selvom formen virker rigtig for spindlen, gør immobiliteten systemet mindre spændende som en model mitotisk spindel. På den anden side giver dette problem mulighed for at undersøge, hvordan man kan ændre eksperimenterne for at skabe mere fluiditet i systemet.
Disse videnskabelige udfordringer giver spændende muligheder, der giver mulighed for ny viden om systemet. For at gøre mikrotubulus tactoider mere bipolære, kunne man bruge kortere mikrotubuli. Der er dog en ekstra udfordring, da mikrotubuli ikke har mange velkarakteriserede cappingproteiner til at kontrollere længden, som actin gør. Anvendelsen af kimdannelse og vækst kræver anvendelse af meget høje koncentrationer af tubulin og GMPCPP til fremstilling af korte mikrotubuli. Den høje tubulinkoncentration resulterer i et større antal filamenter i systemet, hvilket gør det vanskeligere at adskille tactoider fra hinanden. Tilføjelsen af nye mikrotubuluskapsler, såsom DARPin33, kan hjælpe med denne situation. Det andet problem med, at mikrotubuli er ubevægelige, kan afhjælpes ved tilsætning af motorproteiner, såsom kinesin-534, som er tetramerer af motorer, der anvendes i mitose. Alternativt kan kunstige dimerer af dimerer af dimerisk kinesin-1 anvendes15.
En anden måde at tilføje mere fluiditet på ville være at tillade mikrotubuli at udføre deres dynamiske ustabilitet, dyrkning og krympning af mikrotubuli. I øjeblikket er mikrotubuli, der er podet med stabile GMPCPP-filamenter og derefter gennemgår dynamisk ustabilitet, langt længere end ønsket for at danne en spindel eller taktoid, hvilket ville resultere i meget lange organisationer som fans eller bundter. Så tilføjelse af mikrotubulus dynamisk ustabilitet skal gøres omhyggeligt for at bevare den taktformede form. Tilsætningen af associerede proteiner og enzymer, der kan kontrollere længden, kan afhjælpe dette problem. For eksempel vil depolymeriserende kinesiner, såsom kinesin-1335, eller skære enzymer, som katanin36, sandsynligvis være nødvendige. Disse eksperimenter er komplekse og vanskelige, selvom de ville være meget indsigtsfulde, uanset hvad resultaterne afslører. Uanset hvilken retning fremtidige eksperimenter tager, kan platformen udviklet her til at skabe mikrotubulus tactoider udsætte ny information på det fysiske grundlag for mikrotubulusorganisation.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke alle Ross Lab-medlemmer i sommeren 2021, især K. Alice Lindsay, for deres hjælp. Dette arbejde blev støttet af et tilskud fra NSF BIO-2134215, der støttede S. Sahu, N. Goodbee, H.B. Lee og J.L. Ross. Et tilskud fra KECK Foundation (Rae Anderson, USD, lead PI) støttede delvist R. Branch og P. Chauhan
2% Dichlorodimethylsilane | GE Healthcare | 118945 | A hydrophobic silane surface treatment. This can be resused upto three times and kept at room temperature for one year. |
5-minute epoxy | Bob Smith Industries | For sealing experimental chambers | |
Acetone | Fisher | 32900HPLC | 100% |
BL21 cells | Bio Labs | C2527I | Competent bacterial cells used to express MAP65 |
Catalase | Sigma | C30-500MG | Part of the oxygen scavenging system. A 300 mg/ml stock is made in ddH2O and stored in 10 μl aliquots in -20°C for upto one year. |
Coverslips (22 mm x 22 mm or 22 mm x 30 mm) | Fisher | 12544-AP | For experimental chambers |
Dithiothreitol | Sigma | 43815-5G | A small molecule that is used to break disulfide bonds and scavenge oxygen. A 1 M stock is made from powder (Sigma) in ddH2O. The solution is aliquoted and stored at -20C for upto one year. The aliquots are used 7-8 times then discarded. |
EGTA | Sigma | E3889-10G | Tubulin buffer base ingredient |
Eppendorf 0.5 ml tubes | Eppendorf | 05 402 18 | For holding experimental solutions |
Ethanol | Fisher | 111000200 | 200 proof |
Filter paper | Whatman | 1004-110 | For cleaning and for pulling solutions through experimental chambers |
Fluorescence microscope with high NA objectives | Nikon | Ti-E, W2 Confocal | For imaging experiments |
Freezer -20°C | Fisherbrand | 13986148 | For storing reagents |
Freezer -80°C | Thermo scientific | 328223H01-C | For storing proteins. |
Glass containers for silanization | Michaels | For preparing experimental chambers – treating cover glasses | |
Glass slides | Fisher | 12544-4 | For experimental chambers |
Glucose | Sigma | G7528-250G | Part of the oxygen scavenging system. A 300 mg/ml stock is made in ddH2O and stored in 10 μl aliquots in -20°C. |
Glucose oxidase | Sigma | G2133-250KU | Part of the oxygen scavenging system. This is stored at 4°C for upto one year. |
GMPCPP | Jenna Bioscience | NU-4055 | Slowly hydrolyzable analog of GTP used to polymerize and stabilize the microtubules by reducing the dynamic instability and spontaneous critical concentration for microtubule nucleation to get a consistent length. We purchase a 10 mM stock from Jena Biosciences and store it at -20°C for upto one year. |
Heating element for microscope | Okolab stage top incubator | For imaging experiments | |
Imidizole | Sigma | I2399 | Used to elute MAP65 protein from Nickel beads to purify MAP65 |
Kimwipes | Fisher | 34155 | For cleaning and for pulling solutions through experimental chambers. |
KOH | Sigma | P250-500 | 1 M in ddH2O, made fresh to prevent acidification over time. |
Liquid Nitrogen | Airgas | NI 230LT22 | To drop freeze aliquots. This can also be used for storage (not recommended) |
MAP65 protein | Ram Dixit | A microtubule-associated protein (MAP) with a molecular weight of 65 kD that is an antiparallel microtubule crosslinker. We have purified an unlabeled and GFP-labeled version of MAP65-1 from Arabidopsis thaliana. We mix the GFP-MAP65 with the unlabeled MAP65 such that 10% of the protein is labeled. The working stock is a 10.8 μM solution. This working solution is stored at 4°C and remade fresh every week. The protocol for purifying the MAP65 and GFP-MAP65 is given in our prior methods chapter (26). | |
MgSO4 | Sigma | MKCJ940 | Tubulin buffer ingredient |
NTA-Nickel beads | Qiagen | 30210 | Beads required to purify 6xHis tagged MAP65 proteins |
Optomicroscan | Nikon | 405 nm laser system which can focus the laser in any desired shape of region of interest | |
PEM80 | Neutral tubulin polymerizing base buffer for solution made from 80 mM K-PIPES, pH 6.8, 1 mM MgSO4, 1 mM EGTA, stored at 4°C for upto one year. | ||
Permanent double-sided tape | 3M – Scotch | 34-8724-5691-7 | For experimental chambers |
Petri dish | Fisher | FB0875713 | For humid chamber |
PIPES | Sigma | P7643-100G | Tubulin buffer base ingredient |
Pluronic-F127 | Sigma | P2443-250G | A block-copolymer with two hydrophilic polyethylene oxide (PEO) blocks on the ends and a hydrophobic center block of polyphenylene oxide (PPO) hydrophobic surface coating we use to prevent protein binding to the surface. Pluronic-F127 is purchased as a powder (Sigma) and dissolved to a 5% (w/v) solution in ddH2O overnight. Once dissolved, the solution can be stored at room temperature for upto one year. |
Polyethylene Glycol | Affymetrix Inc | 19966 500 GM | A crowding agent used to create depletion forces to bring tactoids to the surface and help to organize microtubules. We create a 5% (w/v) solution of 100 kDa PEG in PEM80. The solution is stored in 4°C for upto one year and placed on the rocker before use. It is viscous, so we recommend using a positive displacement pipette to work with it. |
Positive displacement pipette | Eppendorf | For pipetting viscous liquids | |
Racks for coverslips | Electron Microscopy Sciences | 72240 | For preparing experimental chambers – treating cover glasses |
Refrigerator 4°C | Fisherbrand | For storing reagents | |
Tubulin Labeled | Cytoskeleton | TL590M | lyophilized rhodamine-labeled tubulin from pig brain is purchased (Cytoskeleton) and stored in -80°C until hydrated in PEM80 and used for upto one year. |
Tubulin protein | Cytoskeleton | T240 | lyophilized tubulin 99% pure unlabeled from pig brain is purchased (Cytoskeleton) and stored in -80°C until hydrated in PEM80 and used for upto one year. |
UV-Ozone | Jelight | Model 342 | For preparing experimental chambers – treating cover glasses |
Stackreg | Biomedical Imaging Group | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/ | plugin for registering time series data to remove drift |
Turboreg | Biomedical Imaging Group | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ | plugin for registering time series data to remove drift |