Denne artikkelen presenterer en protokoll for dannelsen av mikrotubule samlinger i form av taktoider ved hjelp av MAP65, en plantebasert mikrotubule crosslinker, og PEG som et trengselmiddel.
Cytoskjelettet er ansvarlig for stor intern organisering og omorganisering i cellen, alt uten leder for å lede endringene. Dette er spesielt tilfelle under mitose eller meiosis, hvor mikrotubulene danner spindelen under celledeling. Spindelen er maskineriet som brukes til å skille genetisk materiale under celledeling. Mot å lage selvorganiserte spindler in vitro, utviklet vi nylig en teknikk for å rekonstituere mikrotubuler i spindellignende forsamlinger med et minimalt sett med mikrotubule-assosierte proteiner og trengselmidler. Spesielt ble MAP65 brukt, som er en antiparallel mikrotubule crosslinker fra planter, en homolog av Ase1 fra gjær og PRC1 fra pattedyrorganismer. Denne crosslinkeren organiserer selv mikrotubuler i lange, tynne, spindellignende mikrotubule selvorganiserte forsamlinger. Disse samlingene ligner også flytende krystall taktoider, og mikrotubuler kan brukes som mesoskala mesogener. Her presenteres protokoller for å skape disse mikrotubule taktoidene, samt for å karakterisere formen på samlingene ved hjelp av fluorescensmikroskopi og bestanddelenes mobilitet ved hjelp av fluorescensgjenvinning etter fotobleking.
Celledeling via mitose er en av de viktigste biologiske prosessene for å opprettholde livet. Mikrotubulfilamentene, som består av tubulin dimers, er essensielle strukturelle elementer i denne prosessen. Det forbigående maskineriet som opprettes i metafase når kromosomene justeres i cellesenteret, kalles den mitotiske spindelen på grunn av formen, som er som en spindel av en vevstol dekket av tråder (figur 1A). Det er veletablert på tvers av mange organismer at mikrotubuler brukes i metafase for å presse og trekke kondenserte kromosomer inn i midten av cellen, justere dem og koble dem opp til mikrotubuler som vil trekke dem fra hverandre i anafase (figur 1B, C). Spindelen dannes i både meiose (figur 1B) og mitose (figur 1C), laget av mange overlappende mikrotubuler som ikke er pakket rundt den sentrale aksen som tråd, men kjører parallelt med grensesnittet. Å lage disse mikrotubule-baserte strukturene krever tilknyttede proteiner som krysskobling og tilhørende enzymer som kan fungere som motorer for å bidra til å presse og trekke kromosomene1.
Studier av meiotiske spindler har vist at mikrotubulene er korte, dynamiske og overlappende i krysskoblede matriser 2,3,4,5,6 (figur 1Di). På grunn av den fysiske organiseringen av disse korte mikrotubulene, ligner den meiotiske spindelen en flytende krystall taktoid (figur 1E). Faktisk har spindler vist seg å samle seg og fusjonere, som man kan forvente av flytende krystall taktoider5.
Mange studier som dateres tilbake til 1960-tallet har brukt fiksering, serielle seksjoner og elektronmikroskopi for å fastslå at det er to typer mikrotubuler inne i den mitotiske spindelen 7,8,9,10. Den første typen kalles kinetochore mikrotubules, som forbinder spindelstangen til kinetochore. Den andre typen kalles interpolare eller polare mikrotubuler, som vokser forbi kromosomene og overlapper ved midtsonen (figur 1Dii) 8,9,10. En tredje type kalles astral mikrotubules, som er utenfor spindelen og forbinder polene til cellekanten; Disse mikrotubule organisasjonene er utenfor omfanget av den aktuelle diskusjonen. Det har nylig vært studier på samspillet mellom augmin6 og gamma-tubulin ring kompleks som påvirker nukleasjonssentre for mikrotubuler, noe som resulterer i en mititotisk spindel med kortere mikrotubuler som i figur 1D.
Siden mikrotubuler er lengre enn de er brede, med et høyt størrelsesforhold og høy stivhet, er de som oppskalerte versjoner av flytende krystallmolekyler. I myk materiefysikk har atomer og molekyler blitt tilnærmet ved hjelp av minimale interaksjoner for å utlede de fysiske mekanismene for faseoverganger, inkludert kjernedannelse og smelting av krystaller11. På samme måte er mikrotubuler mesoskala objekter som er oppskalerte versjoner av flytende krystallmolekyler, noe som gir innsikt i fysikken til flytende krystalldynamikk, inkludert kjernen og veksten av de nematiske fasene fra isotrope. Videre, som diskutert ovenfor, viser den meiotiske spindelen egenskaper som en flytende krystall taktoid, en nematisk tilstand som nukleerer og vokser fra isotropisk tilstand av flytende krystallmolekyler 3,4,5. For taktoider er kjernedannelse og vekst som for andre krystaller (dvs. krever en relativt høy konsentrasjon av mesogener [molekylene som danner flytende krystaller]). Den unike “spindel” formen på taktoiden kommer fra den lokale justeringen av flytende krystallmetogener som justerer seg inn i den nematiske fasen (figur 1E). De kan ikke danne en avrundet krystall fordi molekylene er svært asymmetriske. Gitt mikrotubulenes natur er det kanskje ikke overraskende at det mititotiske spindelmaskineriet laget av en høy lokal konsentrasjon av mikrotubuler også er av samme form, enten det kalles taktoid eller spindel. Taktoider kan være bipolare, med poler i de koniske endene (figur 1Ei), eller homogen, med poler effektivt ved uendelig (figur 1Eii).
Gitt betydningen av spindeldannelse, har det pågått innsats mot selvorganisert spindeldannelse in vitro ved å demonstrere mikrotubulkondensasjon i bunter via ioniske arter12,13, trengselmidler som skaper uttømmingsinteraksjoner14,15, og spesifikke mikrotubule krysskoblingsproteiner 13,16,17,18,19, 21. Overraskende, selv om disse midlene alle jobber for å øke den lokale konsentrasjonen av mikrotubuler, resulterer de ofte i lange mikrotubulebunter, men ikke taktoider. En grunn til at disse buntene er lange, kan være at mikrotubulene som består av dem også er lange. Nylig arbeid med kortere mikrotubuler rapporterte også lengre bunter som ikke er avsmalnet på slutten15; I dette tilfellet holdes buntene sammen med motorproteiner som forårsaker forlengelse av buntene og dermed gjør dem lengre. Korte mikrotubuler med ikke-ekstensile krysskoblinger er nødvendig for koniske, spindellignende forsamlinger, som beskrevet her.
Nylig har vi utviklet en teknikk for å muliggjøre opprettelse av mikrotubule taktoider ved hjelp av antiparallel crosslinker, MAP65, i nærvær av nukleerende stabile mikrotubuler22. Mikrotubulene måtte være korte, men få kjente regulatorer av mikrotubullengde kan dekke mikrotubuler mot dynamisk ustabilitet eller ende-til-ende annealing. I stedet ble GMPCPP brukt til å nukleere og stabilisere filamentene etter vekst. Dette tillot å skape en høy tetthet av korte mikrotubuler som selv kunne organisere seg i taktoider. Disse taktoidene var homogene når de ble sett under birefringence. I tillegg til korte mikrotubuler ble en spesifikk antiparallel crosslinker, MAP65, brukt til å danne taktoidene (figur 2). MAP65 er et plantemikrotubul-assosiert protein i PRC1/Ase1-familien av mititotiske krysskoblinger23. MAP65 eksisterer som en dimer, med en sterk affinitet til å binde seg til seg selv så vel som mikrotubulene24. I motsetning til den meiotiske spindelen og taktoidene som observeres med aktinfilamenter 25,26,27, som er bipolare og har de væskelignende egenskapene til flytende krystaller, har mikrotubule taktoider blitt observert å være faste 22,28.
Her presenteres protokoller for å skape mikrotubule taktoider og karakterisere formen på samlingene og mobiliteten til bestanddelene ved hjelp av fluorescensbaserte teknikker.
Metodene beskrevet her har blitt brukt i flere artikler for å lage mikrotubule taktoider (figur 2)22,28. Disse eksperimentene er biologisk relevante for å bidra til å avdekke de organisatoriske prinsippene som styrer formen og stabiliteten til den mitotiske eller meiotiske spindelen i de fleste celletyper. I tillegg er mikrotubuler modell flytende krystallmetogener som kan hjelpe til med å lære mer om hvordan flytende krystaller nukleerer og vokser nematiske faser fra isotrope faser.
Prosedyren som er skissert her har flere fordeler for å utforske mikrotubul selvorganisering. For det første er det svært reproduserbart, etter å ha blitt utført i laboratoriet av mange studenter, inkludert elever på videregående skole, med liten forkunnskap eller trening før de begynte i laboratoriet. Taktoidene er birefringent22, slik at de kan sees i overført lys i tillegg til fluorescensmikroskopi, noe som gjør denne metoden tilgjengelig for mange laboratorier og denne eksperimentelle prosedyren som kan tilpasses pedagogiske formål, i tillegg til avansert forskning. Til slutt åpner denne prosessen veier for å fortsette å forstå og sondere biologiske systemer i en nedstrippet, reduksjonistisk tilnærming, slik at man kan forstå hvordan hver ekstra tilstand, protein eller additiv kan endre selvorganisering av taktoider og kanskje til slutt spindelen. Mål for bedre biomimicry inkluderer aktivitet, fluiditet og filament polaritet sortering.
Det kan være flere faktorer som påvirker eksperimentet og gir uventede resultater. Hvis taktoidene for eksempel ikke dannes (figur 2), men viftelignende mønstre observeres, er MAP65 sannsynligvis ikke til stede eller ikke bindende for mikrotubulene22,28. Dette bør også være åpenbart i MAP65 fluorescenskanalen fordi GFP-MAP65 ikke vil være bundet til mikrotubulene.
Hvis taktoidene ikke dannes og bakgrunnen vises som flekker på glasset, kan dette skyldes overflatebelegget. Når den er utført, varer silaniseringen bare 1 måned på coverlips. Når den slites av, vil tubulinen kunne binde seg til den eksponerte overflaten ikke-spesifikt. Denne bindingen vil forekomme i rare mønstre.
Hvis taktoidene ikke dannes og tubulin observeres i aggregater av forskjellige former og størrelser, kan dette skyldes tubulin av dårlig kvalitet. Tubulin kan sentrifugeres for å fjerne innledende aggregater som kan drive denne off-pathway aggregasjonen i stedet for mikrotubul polymerisering. Hvis overflaten er bindende til tubulinen, kan den også tømme tubulinen i løsningen. Lave konsentrasjoner av tubulin, under den kritiske konsentrasjonen for polymerisering av mikrotubuler, kan resultere i aggregater.
I FRAP-eksperimenter, hvis MAP65-kanalen ikke viser noen gjenoppretting (figur 5), er det mulig at fotobleaching fotodamaging mikrotubules. Fotodamage forårsaker lokalisert ødeleggelse av filamentene. Dette kan kontrolleres ved undersøkelse i den overførte kanalen. Mikrotubule taktoider er synlige i den overførte kanalen gjennom en høy indeks av brytningskonflikt med det omkringliggende vannet. Lysindusert fotodamage vil vises som et brennmerke eller tap av kontrast i overført lysavbildning på stedet der avkastningen utsettes for fotobleking. Hvis dette skjer, må laseren eller lyseffekten reduseres for å hemme proteinenes fotodamage.
Det var flere utfordringer i denne prosedyren og tilnærmingen. Et problem er at lengdemålene for øyeblikket utføres for hånd ved å klikke på bildet. Denne metoden, selv om den er grei, kan føre til stor usikkerhet. Breddemålet som bruker tverrsnittet og tilpasningen til en gaussianer, er en bedre metode for å kvantifisere størrelsen. En lignende metode kan brukes for lengden. Et annet problem er at noen ganger kan taktoidene, fordi de er så lange og tynne, bøye seg. Dette gjør kvantifisering av lengden vanskeligere. Konturlengden kan kvantifiseres ved hjelp av en segmentert linje, men det er ekstra usikkerhet hver gang et segment legges til.
Fra et vitenskapelig perspektiv har denne tilnærmingen noen andre utfordringer for bruken som modell for flytende krystaller eller spindler. Den første utfordringen har vært den lange, tynne formen på taktoidene som mikrotubuler skaper (figur 3 og figur 4). Som nevnt i tidligere publikasjoner22, er mikrotubule taktoider homogene taktoider, ikke bipolare. Dette betyr at mikrotubulene som utgjør formen ikke reorienterer for å peke mot spissene på strukturen. I stedet er alle mikrotubulene parallelle med den lange aksen, og “polene” ligger ved uendelig. Dette er svært forskjellig fra taktoidene som observeres for molekylære flytende krystaller eller til og med for aktin eller DNA som også kan fungere som flytende krystallmetogener. I disse andre systemene er taktoidene bipolare, og når de ses i kryssede polarisatorer, viser de de fortellende tegn på reorientering av stengene.
En annen stor utfordring i dette systemet er at mikrotubulene er immobile inne i taktoiden. Dette er klart fra FRAP-eksperimenter og analyse, da utvinningen av mikrotubulene er svært lav. Deres solide natur gjør mikrotubule taktoider mindre verdifulle som store flytende krystallanaloger. Den nematiske fasen av en flytende krystall skal ha både flytende (væske) og krystall (organisert) egenskaper. Selv om formen virker riktig for spindelen, gjør immobiliteten systemet mindre spennende som en modellgeitotisk spindel. På den annen side gir dette problemet muligheter til å undersøke hvordan man kan endre forsøkene for å skape mer flyt i systemet.
Disse vitenskapelige utfordringene gir spennende muligheter som vil gi ny kunnskap om systemet. For å gjøre mikrotubule taktoidene mer bipolare, kan man bruke kortere mikrotubuler. Det er imidlertid en ekstra utfordring, siden mikrotubuler ikke har mange godt karakteriserte cappingproteiner for å kontrollere lengden som aktin gjør. Bruk av kjernedannelse og vekst krever bruk av svært høye konsentrasjoner av tubulin og GMPCPP for å lage korte mikrotubuler. Den høye tubulinkonsentrasjonen resulterer i et større antall filamenter i systemet, noe som gjør det vanskeligere å skille taktoider fra hverandre. Tillegg av nye mikrotubule cappers, for eksempel DARPin33, kan hjelpe med denne situasjonen. Det andre problemet med at mikrotubulene er immobile, kan reduseres ved tilsetning av motorproteiner, som kinesin-534, som er tetramerer av motorer som brukes i mitose. Alternativt kan kunstige dimmere av dimeriske kinesin-1 brukes15.
En annen måte å legge til mer flyt på ville være å la mikrotubulene utføre sin dynamiske ustabilitet, vekst og krymping av mikrotubuler. For tiden er mikrotubuler som er sådd med stabile GMPCPP-filamenter og deretter gjennomgår dynamisk ustabilitet langt lengre enn ønsket for å danne en spindel eller taktoid, noe som vil resultere i svært lange organisasjoner som fans eller bunter. Så å legge til mikrotubul dynamisk ustabilitet må gjøres nøye for å bevare taktoidformen. Tilsetningen av tilknyttede proteiner og enzymer som kan kontrollere lengden, kan redusere dette problemet. For eksempel vil depolymeriserende kinesiner, som kinesin-1335, eller kutte enzymer, som katanin36, sannsynligvis være nødvendig. Disse eksperimentene er komplekse og vanskelige, selv om de ville være veldig innsiktsfulle uansett hva resultatene avslører. Uansett hvilken retning fremtidige eksperimenter tar, kan plattformen som er utviklet her for å lage mikrotubule taktoider, avsløre ny informasjon på fysisk grunnlag av mikrotubulorganisasjon.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil takke alle Ross Lab-medlemmene sommeren 2021, spesielt K. Alice Lindsay, for deres hjelp. Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra NSF BIO-2134215 som støttet S. Sahu, N. Goodbee, H.B. Lee og J.L. Ross. Et stipend fra KECK Foundation (Rae Anderson, USD, lead PI) støttet delvis R. Branch og P. Chauhan
2% Dichlorodimethylsilane | GE Healthcare | 118945 | A hydrophobic silane surface treatment. This can be resused upto three times and kept at room temperature for one year. |
5-minute epoxy | Bob Smith Industries | For sealing experimental chambers | |
Acetone | Fisher | 32900HPLC | 100% |
BL21 cells | Bio Labs | C2527I | Competent bacterial cells used to express MAP65 |
Catalase | Sigma | C30-500MG | Part of the oxygen scavenging system. A 300 mg/ml stock is made in ddH2O and stored in 10 μl aliquots in -20°C for upto one year. |
Coverslips (22 mm x 22 mm or 22 mm x 30 mm) | Fisher | 12544-AP | For experimental chambers |
Dithiothreitol | Sigma | 43815-5G | A small molecule that is used to break disulfide bonds and scavenge oxygen. A 1 M stock is made from powder (Sigma) in ddH2O. The solution is aliquoted and stored at -20C for upto one year. The aliquots are used 7-8 times then discarded. |
EGTA | Sigma | E3889-10G | Tubulin buffer base ingredient |
Eppendorf 0.5 ml tubes | Eppendorf | 05 402 18 | For holding experimental solutions |
Ethanol | Fisher | 111000200 | 200 proof |
Filter paper | Whatman | 1004-110 | For cleaning and for pulling solutions through experimental chambers |
Fluorescence microscope with high NA objectives | Nikon | Ti-E, W2 Confocal | For imaging experiments |
Freezer -20°C | Fisherbrand | 13986148 | For storing reagents |
Freezer -80°C | Thermo scientific | 328223H01-C | For storing proteins. |
Glass containers for silanization | Michaels | For preparing experimental chambers – treating cover glasses | |
Glass slides | Fisher | 12544-4 | For experimental chambers |
Glucose | Sigma | G7528-250G | Part of the oxygen scavenging system. A 300 mg/ml stock is made in ddH2O and stored in 10 μl aliquots in -20°C. |
Glucose oxidase | Sigma | G2133-250KU | Part of the oxygen scavenging system. This is stored at 4°C for upto one year. |
GMPCPP | Jenna Bioscience | NU-4055 | Slowly hydrolyzable analog of GTP used to polymerize and stabilize the microtubules by reducing the dynamic instability and spontaneous critical concentration for microtubule nucleation to get a consistent length. We purchase a 10 mM stock from Jena Biosciences and store it at -20°C for upto one year. |
Heating element for microscope | Okolab stage top incubator | For imaging experiments | |
Imidizole | Sigma | I2399 | Used to elute MAP65 protein from Nickel beads to purify MAP65 |
Kimwipes | Fisher | 34155 | For cleaning and for pulling solutions through experimental chambers. |
KOH | Sigma | P250-500 | 1 M in ddH2O, made fresh to prevent acidification over time. |
Liquid Nitrogen | Airgas | NI 230LT22 | To drop freeze aliquots. This can also be used for storage (not recommended) |
MAP65 protein | Ram Dixit | A microtubule-associated protein (MAP) with a molecular weight of 65 kD that is an antiparallel microtubule crosslinker. We have purified an unlabeled and GFP-labeled version of MAP65-1 from Arabidopsis thaliana. We mix the GFP-MAP65 with the unlabeled MAP65 such that 10% of the protein is labeled. The working stock is a 10.8 μM solution. This working solution is stored at 4°C and remade fresh every week. The protocol for purifying the MAP65 and GFP-MAP65 is given in our prior methods chapter (26). | |
MgSO4 | Sigma | MKCJ940 | Tubulin buffer ingredient |
NTA-Nickel beads | Qiagen | 30210 | Beads required to purify 6xHis tagged MAP65 proteins |
Optomicroscan | Nikon | 405 nm laser system which can focus the laser in any desired shape of region of interest | |
PEM80 | Neutral tubulin polymerizing base buffer for solution made from 80 mM K-PIPES, pH 6.8, 1 mM MgSO4, 1 mM EGTA, stored at 4°C for upto one year. | ||
Permanent double-sided tape | 3M – Scotch | 34-8724-5691-7 | For experimental chambers |
Petri dish | Fisher | FB0875713 | For humid chamber |
PIPES | Sigma | P7643-100G | Tubulin buffer base ingredient |
Pluronic-F127 | Sigma | P2443-250G | A block-copolymer with two hydrophilic polyethylene oxide (PEO) blocks on the ends and a hydrophobic center block of polyphenylene oxide (PPO) hydrophobic surface coating we use to prevent protein binding to the surface. Pluronic-F127 is purchased as a powder (Sigma) and dissolved to a 5% (w/v) solution in ddH2O overnight. Once dissolved, the solution can be stored at room temperature for upto one year. |
Polyethylene Glycol | Affymetrix Inc | 19966 500 GM | A crowding agent used to create depletion forces to bring tactoids to the surface and help to organize microtubules. We create a 5% (w/v) solution of 100 kDa PEG in PEM80. The solution is stored in 4°C for upto one year and placed on the rocker before use. It is viscous, so we recommend using a positive displacement pipette to work with it. |
Positive displacement pipette | Eppendorf | For pipetting viscous liquids | |
Racks for coverslips | Electron Microscopy Sciences | 72240 | For preparing experimental chambers – treating cover glasses |
Refrigerator 4°C | Fisherbrand | For storing reagents | |
Tubulin Labeled | Cytoskeleton | TL590M | lyophilized rhodamine-labeled tubulin from pig brain is purchased (Cytoskeleton) and stored in -80°C until hydrated in PEM80 and used for upto one year. |
Tubulin protein | Cytoskeleton | T240 | lyophilized tubulin 99% pure unlabeled from pig brain is purchased (Cytoskeleton) and stored in -80°C until hydrated in PEM80 and used for upto one year. |
UV-Ozone | Jelight | Model 342 | For preparing experimental chambers – treating cover glasses |
Stackreg | Biomedical Imaging Group | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/ | plugin for registering time series data to remove drift |
Turboreg | Biomedical Imaging Group | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ | plugin for registering time series data to remove drift |