Denna artikel presenterar ett protokoll för bildandet av mikrotubuliaggregat i form av taktoider med MAP65, en växtbaserad mikrotubulär tvärbindare och PEG som trängselmedel.
Cytoskeletten ansvarar för större intern organisation och omorganisation inom cellen, allt utan en chef som styr förändringarna. Detta är särskilt fallet under mitos eller meios, där mikrotubuli bildar spindeln under celldelning. Spindeln är det maskineri som används för att separera genetiskt material under celldelning. För att skapa självorganiserade spindlar in vitro utvecklade vi nyligen en teknik för att rekonstruera mikrotubuli till spindelliknande enheter med en minimal uppsättning mikrotubuliassocierade proteiner och trängselmedel. Specifikt användes MAP65, som är en antiparallell mikrotubulär tvärbindare från växter, en homolog av Ase1 från jäst och PRC1 från däggdjursorganismer. Denna tvärbindare organiserar själv mikrotubuli i långa, tunna, spindelliknande mikrotubuli självorganiserade sammansättningar. Dessa sammansättningar liknar också flytande kristalltaptoider, och mikrotubuli kan användas som mesoskala mesogener. Här presenteras protokoll för att skapa dessa mikrotubuli-taktoider, liksom för att karakterisera formen på enheterna med användning av fluorescensmikroskopi och rörligheten hos beståndsdelarna med användning av fluorescensåtervinning efter fotoblekning.
Celldelning via mitos är en av de viktigaste biologiska processerna för att upprätthålla livet. Mikrotubulifilamenten, som består av tubulindimerer, är väsentliga strukturella element i denna process. Det övergående maskineriet som skapas i metafas när kromosomerna är i linje i cellcentret kallas den mitotiska spindeln på grund av dess form, som är som en spindel av en vävstol täckt av trådar (figur 1A). Det är väletablerat i många organismer att mikrotubuli används i metafas för att trycka och dra kondenserade kromosomer in i mitten av cellen, anpassa dem och ansluta dem till mikrotubuli som kommer att dra dem isär i anafas (Figur 1B, C). Spindeln bildas i både meios (figur 1B) och mitos (figur 1C), skapad av många överlappande mikrotubuli som inte lindas runt den centrala axeln som tråd utan löper parallellt med gränssnittet. Att skapa dessa mikrotubulibaserade strukturer kräver associerade proteiner som tvärbinder och associerade enzymer som kan fungera som motorer för att hjälpa till att trycka och dra kromosomerna1.
Studier av meiotiska spindlar har visat att mikrotubuli är korta, dynamiska och överlappande i tvärbundna arrayer 2,3,4,5,6 (figur 1Di). På grund av den fysiska organisationen av dessa korta mikrotubuli liknar den meiotiska spindeln en flytande kristall taktoid (Figur 1E). Faktum är att spindlar har visat sig samlas och smälta samman, som man kan förvänta sig av flytande kristalltaptoider5.
Många studier som går tillbaka till 1960-talet har använt fixering, seriella sektioner och elektronmikroskopi för att bestämma att det finns två typer av mikrotubuli inuti den mitotiska spindeln 7,8,9,10. Den första typen kallas kinetochore mikrotubuli, som förbinder spindelpolen med kinetokore. Den andra typen kallas interpolära eller polära mikrotubuli, som växer förbi kromosomerna och överlappar varandra vid mittzonen (Figur 1Dii)8,9,10. En tredje typ kallas de astrala mikrotubuli, som ligger utanför spindeln och förbinder polerna med cellkanten; dessa mikrotubuliorganisationer ligger utanför ramen för den aktuella diskussionen. Det har nyligen gjorts studier om interaktionen mellan augmin6 och gamma-tubulinringkomplex som påverkar kärnbildningscentra för mikrotubuli, vilket resulterar i en mitotisk spindel med kortare mikrotubuli som i figur 1D.
Eftersom mikrotubuli är längre än de är breda, med ett högt bildförhållande och hög styvhet, är de som uppskalade versioner av flytande kristallmolekyler. Inom mjukämnesfysik har atomer och molekyler approximerats med hjälp av minimala interaktioner för att härleda de fysikaliska mekanismerna för fasövergångar, inklusive kärnbildning och smältning av kristaller11. På samma sätt är mikrotubuli mesoskalaobjekt som är uppskalade versioner av flytande kristallmolekyler, vilket ger insikter i fysiken för flytande kristalldynamik, inklusive kärnbildning och tillväxt av de nematiska faserna från isotropa. Vidare, som diskuterats ovan, visar den meiotiska spindeln egenskaper som de hos en flytande kristall taktoid, ett nematiskt tillstånd som kärnar och växer från det isotropa tillståndet hos flytande kristallmolekyler 3,4,5. För taktoider är kärnbildning och tillväxt som för andra kristaller (dvs kräver en relativt hög koncentration av mesogener [molekylerna som bildar flytande kristaller]). Den unika “spindel” -formen på taktoiden kommer från den lokala inriktningen av de flytande kristallmesogenerna som anpassar sig till den nematiska fasen (figur 1E). De kan inte bilda en rundad kristall eftersom molekylerna är mycket asymmetriska. Med tanke på mikrotubulis natur är det kanske inte förvånande att det mitotiska spindelmaskineriet tillverkat av en hög lokal koncentration av mikrotubuli också har samma form, oavsett om det kallas en taktoid eller spindel. Tactoider kan vara bipolära, med poler vid de avsmalnande ändarna (figur 1Ei), eller homogena, med poler effektivt vid oändligheten (figur 1Eii).
Med tanke på vikten av spindelbildning har ansträngningar pågått mot självorganiserad spindelbildning in vitro genom att demonstrera mikrotubulär kondensation i buntar via joniska arter12,13, trängselmedel som skapar utarmningsinteraktioner 14,15 och specifika mikrotubuli tvärbindande proteiner 13,16,17,18,19, 21. Överraskande, även om dessa medel alla arbetar för att öka den lokala koncentrationen av mikrotubuli, resulterar de ofta i långa mikrotubulibuntar men inte taktoider. En anledning till att dessa buntar är långa kan vara att mikrotubuli som utgör dem också är långa. Nyligen utfört arbete med kortare mikrotubuli rapporterade också längre buntar som inte är avsmalnande i slutetav 15; i detta fall hålls buntarna ihop med motorproteiner som orsakar förlängning av buntarna och därigenom gör dem längre. Korta mikrotubuli med icke-extensila tvärbindare behövs för avsmalnande, spindelliknande enheter, som beskrivs här.
Nyligen har vi utvecklat en teknik för att möjliggöra skapandet av mikrotubulära takttoider med hjälp av den antiparallella tvärbindaren, MAP65, i närvaro av kärnbildande stabila mikrotubuli22. Mikrotubuli behövde vara korta, men få kända regulatorer av mikrotubulilängd kan täcka mikrotubuli mot dynamisk instabilitet eller glödgning från ände till ände. Istället användes GMPCPP för att kärnbilda och stabilisera filamenten efter tillväxt. Detta möjliggjorde skapandet av en hög densitet av korta mikrotubuli som kunde självorganisera sig i taktoider. Dessa taktoider var homogena när de betraktades under birefringence. Förutom korta mikrotubuli användes en specifik antiparallell tvärbindare, MAP65, för att bilda taktoiderna (figur 2). MAP65 är ett växtmikrotubuliassocierat protein i PRC1/Ase1-familjen av mitotiska tvärbindare23. MAP65 existerar som en dimer, med en stark affinitet att binda till sig själv såväl som mikrotubuli24. Till skillnad från den meiotiska spindeln och taktoiderna som observerats med aktinfilament 25,26,27, som är bipolära och har de vätskeliknande egenskaperna hos flytande kristaller, har mikrotubuli taktoider observerats vara fastliknande22,28.
Här presenteras protokoll för att skapa mikrotubuli-takttoider och karakterisera formen på sammansättningarna och rörligheten hos beståndsdelarna med hjälp av fluorescensbaserade tekniker.
Metoderna som beskrivs här har använts i flera artiklar för att skapa mikrotubuli takttoider (Figur 2)22,28. Dessa experiment är biologiskt relevanta för att hjälpa till att avslöja de organisatoriska principerna som styr formen och stabiliteten hos den mitotiska eller meiotiska spindeln i de flesta celltyper. Dessutom är mikrotubuli modell flytande kristallmesogener som kan hjälpa till att lära sig mer om hur flytande kristaller kärnar och växer nematiska faser från isotropa faser.
Förfarandet som beskrivs här har flera fördelar för att utforska mikrotubuli självorganisation. För det första är det mycket reproducerbart, efter att ha utförts i labbet av många studenter, inklusive gymnasieelever, med liten förkunskap eller träning innan de börjar i labbet. Taktoiderna är birefringenta22, vilket gör att de kan ses i överfört ljus förutom fluorescensmikroskopi, vilket gör denna metod tillgänglig för många laboratorier och detta experimentella förfarande anpassningsbart till utbildningsändamål, förutom avancerad forskning. Slutligen öppnar denna process vägar för att fortsätta förstå och undersöka biologiska system i ett avskalat, reduktionistiskt tillvägagångssätt, så att man kan förstå hur varje ytterligare tillstånd, protein eller tillsats kan förändra självorganisationen av takttoider och kanske i slutändan spindeln. Mål för bättre biomimik inkluderar sortering av aktivitet, fluiditet och filamentpolaritet.
Det kan finnas flera faktorer som påverkar experimentet som ger oväntade resultat. Till exempel, om takttoider inte bildas (figur 2) men fläktliknande mönster observeras, är MAP65 sannolikt inte närvarande eller inte bindande för mikrotubuli22,28. Detta borde också vara uppenbart i MAP65-fluorescenskanalen eftersom GFP-MAP65 inte kommer att vara bunden till mikrotubuli.
Om taktoiderna inte bildas och bakgrunden visas som fläckar på glaset kan det bero på ytbeläggningen. När silaniseringen har utförts varar den bara 1 månad på täckglas. När det slits av kommer tubulinet att kunna binda till den exponerade ytan icke-specifikt. Denna bindning kommer att ske i udda mönster.
Om taktoiderna inte bildas och tubulinet observeras i aggregat av olika former och storlekar, kan detta bero på tubulin av dålig kvalitet. Tubulin kan centrifugeras för att avlägsna initiala aggregat som kan driva denna off-pathway-aggregering istället för mikrotubulipolymerisation. Om ytan är bindande för tubulinet kan den också tömma tubulinet i lösningen. Låga koncentrationer av tubulin, under den kritiska koncentrationen för polymerisering av mikrotubuli, kan resultera i aggregat.
I FRAP-experiment, om MAP65-kanalen inte visar någon återhämtning (figur 5), är det möjligt att fotoblekningen skadade mikrotubuli. Fotoskador orsakar lokal förstöring av filamenten. Detta kan kontrolleras genom undersökning i den överförda kanalen. Mikrotubuli taktoider är synliga i den överförda kanalen genom ett högt brytningsindex som inte överensstämmer med det omgivande vattnet. Ljusinducerad fotoskada kommer att visas som ett brännmärke eller förlust av kontrast vid överföring av ljusavbildning på platsen för ROI som utsätts för fotoblekning. Om detta inträffar måste lasern eller ljuseffekten minskas för att hämma proteinernas fotoskador.
Det fanns flera utmaningar som uppstod i detta förfarande och tillvägagångssätt. Ett problem är att längdmåtten för närvarande utförs för hand genom att klicka på bilden. Även om denna metod är enkel kan den leda till stor osäkerhet. Breddmätningen som använder tvärsnittet och monteringen till en Gaussian är en bättre metod för att kvantifiera storleken. En liknande metod skulle kunna användas för längden. En andra fråga är att ibland kan takttoider, eftersom de är så långa och tunna, böjas. Detta gör det svårare att kvantifiera längden. Konturlängden kan kvantifieras med hjälp av en segmenterad linje, men det finns en extra osäkerhet varje gång ett segment läggs till.
Ur ett vetenskapligt perspektiv har detta tillvägagångssätt några andra utmaningar för dess användning som modell för flytande kristaller eller spindlar. Den första utmaningen har varit den långa, tunna formen på de taktoider som mikrotubuli skapar (figur 3 och figur 4). Som noterats i tidigare publikationer22 är mikrotubulära takttoider homogena taktoider, inte bipolära. Detta innebär att mikrotubuli som utgör formen inte omorienterar för att peka mot strukturens spetsar. Istället är alla mikrotubuli parallella med den långa axeln och “polerna” ligger i oändligheten. Detta skiljer sig mycket från de taktoider som observerats för molekylära flytande kristaller eller till och med för aktin eller DNA som också kan fungera som flytande kristallmesogener. I dessa andra system är takttoider bipolära och när de ses i korsade polarisatorer visar de de tydliga tecknen på omorientering av stavarna.
En andra stor utmaning i detta system är att mikrotubuli är orörliga inuti takten. Detta framgår tydligt av FRAP-experiment och analyser eftersom återhämtningen av mikrotubuli är mycket låg. Deras fasta natur gör mikrotubuli tactoider mindre värdefulla som storskaliga flytande kristallanaloger. Den nematiska fasen av en flytande kristall bör ha både flytande (flytande) och kristall (organiserade) egenskaper. Även om formen verkar rätt för spindeln, gör orörligheten systemet mindre spännande som en modell mitotisk spindel. Å andra sidan ger denna fråga möjligheter att undersöka hur man kan modifiera experimenten för att skapa mer flyt i systemet.
Dessa vetenskapliga utmaningar erbjuder spännande möjligheter som möjliggör ny kunskap om systemet. För att göra mikrotubuli-takttoider mer bipolära kan man använda kortare mikrotubuli. Det finns dock en extra utmaning, eftersom mikrotubuli inte har många väl karakteriserade kapslingsproteiner för att kontrollera längden som aktin gör. Användningen av kärnbildning och tillväxt kräver användning av mycket höga koncentrationer av tubulin och GMPCPP för att göra korta mikrotubuli. Den höga tubulinkoncentrationen resulterar i ett större antal filament i systemet, vilket gör det svårare att separera takttoider från varandra. Tillägget av nya mikrotubulikapslar, såsom DARPin33, kan hjälpa till med denna situation. Den andra frågan om att mikrotubuli är orörliga kan mildras genom tillsats av motorproteiner, såsom kinesin-534, som är tetramerer av motorer som används vid mitos. Alternativt kan konstgjorda dimerer av dimerisk kinesin-1 användas15.
Ett annat sätt att lägga till mer flyt skulle vara att låta mikrotubuli utföra sin dynamiska instabilitet, växande och krympande mikrotubuli. För närvarande är mikrotubuli som är sådda med stabila GMPCPP-filament och sedan genomgår dynamisk instabilitet mycket längre än önskat för att bilda en spindel eller taktoid, vilket skulle resultera i mycket långa organisationer som fläktar eller buntar. Så att lägga till mikrotubuli dynamisk instabilitet skulle behöva göras noggrant för att bevara taktformen. Tillsatsen av associerade proteiner och enzymer som kan kontrollera längden kan mildra problemet. Till exempel skulle depolymeriserande kinesiner, såsom kinesin-1335, eller avskiljande enzymer, som katanin36, sannolikt behövas. Dessa experiment är komplexa och svåra, även om de skulle vara mycket insiktsfulla oavsett vad resultaten avslöjar. Oavsett vilken riktning framtida experiment tar, kan plattformen som utvecklats här för att skapa mikrotubuli-takttoider exponera ny information på den fysiska grunden för mikrotubuliorganisation.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka alla rosslabbmedlemmar sommaren 2021, särskilt K. Alice Lindsay, för deras hjälp. Detta arbete stöddes av ett bidrag från NSF BIO-2134215 som stödde S. Sahu, N. Goodbee, H.B. Lee och J.L. Ross. Ett bidrag från KECK Foundation (Rae Anderson, USD, lead PI) stödde delvis R. Branch och P. Chauhan
2% Dichlorodimethylsilane | GE Healthcare | 118945 | A hydrophobic silane surface treatment. This can be resused upto three times and kept at room temperature for one year. |
5-minute epoxy | Bob Smith Industries | For sealing experimental chambers | |
Acetone | Fisher | 32900HPLC | 100% |
BL21 cells | Bio Labs | C2527I | Competent bacterial cells used to express MAP65 |
Catalase | Sigma | C30-500MG | Part of the oxygen scavenging system. A 300 mg/ml stock is made in ddH2O and stored in 10 μl aliquots in -20°C for upto one year. |
Coverslips (22 mm x 22 mm or 22 mm x 30 mm) | Fisher | 12544-AP | For experimental chambers |
Dithiothreitol | Sigma | 43815-5G | A small molecule that is used to break disulfide bonds and scavenge oxygen. A 1 M stock is made from powder (Sigma) in ddH2O. The solution is aliquoted and stored at -20C for upto one year. The aliquots are used 7-8 times then discarded. |
EGTA | Sigma | E3889-10G | Tubulin buffer base ingredient |
Eppendorf 0.5 ml tubes | Eppendorf | 05 402 18 | For holding experimental solutions |
Ethanol | Fisher | 111000200 | 200 proof |
Filter paper | Whatman | 1004-110 | For cleaning and for pulling solutions through experimental chambers |
Fluorescence microscope with high NA objectives | Nikon | Ti-E, W2 Confocal | For imaging experiments |
Freezer -20°C | Fisherbrand | 13986148 | For storing reagents |
Freezer -80°C | Thermo scientific | 328223H01-C | For storing proteins. |
Glass containers for silanization | Michaels | For preparing experimental chambers – treating cover glasses | |
Glass slides | Fisher | 12544-4 | For experimental chambers |
Glucose | Sigma | G7528-250G | Part of the oxygen scavenging system. A 300 mg/ml stock is made in ddH2O and stored in 10 μl aliquots in -20°C. |
Glucose oxidase | Sigma | G2133-250KU | Part of the oxygen scavenging system. This is stored at 4°C for upto one year. |
GMPCPP | Jenna Bioscience | NU-4055 | Slowly hydrolyzable analog of GTP used to polymerize and stabilize the microtubules by reducing the dynamic instability and spontaneous critical concentration for microtubule nucleation to get a consistent length. We purchase a 10 mM stock from Jena Biosciences and store it at -20°C for upto one year. |
Heating element for microscope | Okolab stage top incubator | For imaging experiments | |
Imidizole | Sigma | I2399 | Used to elute MAP65 protein from Nickel beads to purify MAP65 |
Kimwipes | Fisher | 34155 | For cleaning and for pulling solutions through experimental chambers. |
KOH | Sigma | P250-500 | 1 M in ddH2O, made fresh to prevent acidification over time. |
Liquid Nitrogen | Airgas | NI 230LT22 | To drop freeze aliquots. This can also be used for storage (not recommended) |
MAP65 protein | Ram Dixit | A microtubule-associated protein (MAP) with a molecular weight of 65 kD that is an antiparallel microtubule crosslinker. We have purified an unlabeled and GFP-labeled version of MAP65-1 from Arabidopsis thaliana. We mix the GFP-MAP65 with the unlabeled MAP65 such that 10% of the protein is labeled. The working stock is a 10.8 μM solution. This working solution is stored at 4°C and remade fresh every week. The protocol for purifying the MAP65 and GFP-MAP65 is given in our prior methods chapter (26). | |
MgSO4 | Sigma | MKCJ940 | Tubulin buffer ingredient |
NTA-Nickel beads | Qiagen | 30210 | Beads required to purify 6xHis tagged MAP65 proteins |
Optomicroscan | Nikon | 405 nm laser system which can focus the laser in any desired shape of region of interest | |
PEM80 | Neutral tubulin polymerizing base buffer for solution made from 80 mM K-PIPES, pH 6.8, 1 mM MgSO4, 1 mM EGTA, stored at 4°C for upto one year. | ||
Permanent double-sided tape | 3M – Scotch | 34-8724-5691-7 | For experimental chambers |
Petri dish | Fisher | FB0875713 | For humid chamber |
PIPES | Sigma | P7643-100G | Tubulin buffer base ingredient |
Pluronic-F127 | Sigma | P2443-250G | A block-copolymer with two hydrophilic polyethylene oxide (PEO) blocks on the ends and a hydrophobic center block of polyphenylene oxide (PPO) hydrophobic surface coating we use to prevent protein binding to the surface. Pluronic-F127 is purchased as a powder (Sigma) and dissolved to a 5% (w/v) solution in ddH2O overnight. Once dissolved, the solution can be stored at room temperature for upto one year. |
Polyethylene Glycol | Affymetrix Inc | 19966 500 GM | A crowding agent used to create depletion forces to bring tactoids to the surface and help to organize microtubules. We create a 5% (w/v) solution of 100 kDa PEG in PEM80. The solution is stored in 4°C for upto one year and placed on the rocker before use. It is viscous, so we recommend using a positive displacement pipette to work with it. |
Positive displacement pipette | Eppendorf | For pipetting viscous liquids | |
Racks for coverslips | Electron Microscopy Sciences | 72240 | For preparing experimental chambers – treating cover glasses |
Refrigerator 4°C | Fisherbrand | For storing reagents | |
Tubulin Labeled | Cytoskeleton | TL590M | lyophilized rhodamine-labeled tubulin from pig brain is purchased (Cytoskeleton) and stored in -80°C until hydrated in PEM80 and used for upto one year. |
Tubulin protein | Cytoskeleton | T240 | lyophilized tubulin 99% pure unlabeled from pig brain is purchased (Cytoskeleton) and stored in -80°C until hydrated in PEM80 and used for upto one year. |
UV-Ozone | Jelight | Model 342 | For preparing experimental chambers – treating cover glasses |
Stackreg | Biomedical Imaging Group | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/ | plugin for registering time series data to remove drift |
Turboreg | Biomedical Imaging Group | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ | plugin for registering time series data to remove drift |