Visualización de las características morfológicas de la unión neuromuscular en el músculo gastrocnemio medial de rata
Summary
El protocolo muestra un método para examinar la correlación espacial entre los terminales presinápticos, los receptores postsinápticos y las células de Schwann perisinápticas en el músculo gastrocnemio medial de la rata utilizando inmunohistoquímica fluorescente con diferentes biomarcadores, a saber, neurofilamento 200, transportador vesicular de acetilcolina, alfa-bungarotoxina y S100.
Abstract
La unión neuromuscular (NMJ) es una estructura compleja que sirve para la comunicación de señales desde la neurona motora hasta el músculo esquelético y consta de tres componentes histológicos esenciales: los terminales axónicos motores presinápticos, los receptores nicotínicos de acetilcolina postsinápticos (AchR) y las células de Schwann perisinápticas (PSC). Con el fin de demostrar las características morfológicas de la NMJ, el músculo gastrocnemio medial de rata se seleccionó como tejido objetivo y se examinó mediante el uso de múltiples tinciones fluorescentes con varios tipos de biomarcadores, incluido el neurofilamento 200 (NF200) y el transportador vesicular de acetilcolina (VAChT) para las fibras nerviosas motoras y sus terminales presinápticas, alfa-bungarotoxina (α-BTX) para las AchR nicotínicas postsinápticas, y S100 para los PSC. En este estudio, la tinción se realizó en dos grupos: en el primer grupo, las muestras se tiñeron con NF200, VAChT y α-BTX, y en el segundo grupo, las muestras se tiñeron con NF200, α-BTX y S100. Se demostró que ambos protocolos pueden demostrar efectivamente la estructura detallada de NMJ. Utilizando el microscopio confocal, se observaron las características morfológicas de los terminales presinápticos, los receptores postsinápticos y el PSC, y se reconstruyeron sus imágenes de pilas Z en un patrón tridimensional para analizar más a fondo la correlación espacial entre los diferentes etiquetados. Desde la perspectiva de la metodología, estos protocolos proporcionan una referencia valiosa para investigar las características morfológicas de la NMJ en condiciones fisiológicas, que también pueden ser adecuadas para evaluar la alteración patológica de la NMJ, como la lesión y regeneración de los nervios periféricos.
Introduction
Como tres componentes estructurales esenciales de la unión neuromuscular (NMJ)1,2,3,4, se han investigado ampliamente los aspectos morfológicos de los terminales axónicos motores presinápticos, la membrana postsináptica que contiene receptores nicotínicos de acetilcolina (AchR) y las células de Schwann perisinápticas (PSC). Se han examinado secciones delgadas y especímenes de montaje entero de los músculos esqueléticos con diferentes técnicas histológicas, como la microscopía electrónica 5,6, la microscopía confocal 7,8 y la microscopía de lámina de luz 9,10. Aunque las características morfológicas de NMJ han sido demostradas por estas técnicas desde diferentes aspectos, como comparación, la microscopía confocal sigue siendo una opción ideal para la obtención de imágenes de la morfología detallada de NMJ.
Recientemente, se han desarrollado muchas tecnologías nuevas para mostrar los componentes estructurales de NMJ. Por ejemplo, los ratones fluorescentes transgénicos thy1-YFP se han utilizado directamente para observar axones motores y placas finales motoras in vivo e in vitro10,11. Además, se ha aplicado la inyección intravenosa de fluorescente α-BTX para revelar la distribución espacial de las placas terminales motoras en músculos esqueléticos de montaje completo de ratones fluorescentes de tipo salvaje y transgénicos, mediante el uso de tratamiento de limpieza óptica de tejidos para su examen con microscopía de lámina de luz 9,12. Sin embargo, además de los elementos pre y postsinápticos que pueden ser vistos por estos métodos avanzados, las PSC no se pueden demostrar al mismo tiempo.
La evidencia acumulada indica que las PSC, como las células gliales periféricas, están estrechamente asociadas con los terminales presinápticos que contribuyen al desarrollo y la estabilidad de la NMJ, la modulación de la actividad sináptica de la NMJ bajo la condición fisiológica y la regeneración de la NMJ después de una lesión nerviosa 13,14,15 . Teniendo en cuenta la arquitectura celular de NMJ, este protocolo es un candidato adecuado para etiquetar simultáneamente las PSC, elementos pre y postsinápticos, y se utiliza potencialmente para evaluar la integridad y plasticidad de la NMJ en condiciones normales y patológicas. Por ejemplo, compare la intensidad de NMJ, la morfología y el volumen de las placas terminales motoras postsinápticas, la inervación y la denervación de NMJ, y el número de PSC en músculos de estado fisiológico y patológico.
El músculo gastrocnemio es el músculo más grande que forma la protuberancia en la pantorrilla, que se disecciona fácilmente mediante la eliminación de la piel y el músculo bíceps femoral de la extremidad. El músculo a menudo se elige para evaluar la atrofia muscular, la degeneración neuromuscular, el rendimiento muscular y la fuerza de la unidad motora ex vivo o in vivo 16,17,18. Sin embargo, la técnica también es adecuada para revelar las características morfológicas de NMJ de varios músculos esqueléticos. Al mismo tiempo, las secciones musculares gruesas pueden revelar una morfología y cantidad más completas de NMJ en comparación con las secciones delgadas 7,8 y las fibras muscularesburladas 19.
En línea con estos estudios, el músculo gastrocnemio medial de rata fue seleccionado como tejido diana en este estudio y se cortó en rodajas a un grosor de 80 μm para múltiples tinciones fluorescentes con varios tipos de biomarcadores de acuerdo con los componentes estructurales de NMJ. Aquí, el neurofilamento 200 (NF200)20,21, el transportador vesicular de acetilcolina (VAChT)22, la alfa-bungarotoxina (α-BTX)23,24 y el S10025,26 se utilizaron para etiquetar fibras nerviosas, terminales presinápticas, afrrómetros postsinápticos y PSC respectivamente. Además, el fondo del tejido muscular y los núcleos celulares se contrateñeron aún más con faloidina y DAPI.
En este estudio, esperamos desarrollar un protocolo refinado para teñir simultáneamente la arquitectura celular de NMJ con sus correspondientes biomarcadores en muestras fijas más gruesas, que es más conveniente para su uso en microscopía confocal y ayuda a obtener mucha más información sobre la estructura detallada de las PSC, elementos pre y postsinápticos, así como su correlación espacial entre sí. Desde la perspectiva de la metodología, este protocolo puede beneficiarse para evaluar las características morfológicas de NMJ en condiciones normales y patológicas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hemos descrito los detalles técnicos necesarios para realizar con éxito la tinción múltiple de cortes musculares y el uso de inmunohistoquímica fluorescente para revelar las características morfológicas de NMJ en las secciones gruesas del músculo gastrocnemio medial de rata. Mediante el uso de este enfoque, los detalles finos y la correlación espacial de las PSC y los elementos pre y postsinápticos pueden analizarse y apreciarse bajo microscopía confocal, y reconstruirse aún más en un patrón tridimensional….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue financiado por el Fondo de Innovación del CACMS (No. CI2021A03407), La Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 82004299) y los Fondos de Investigación Fundamental para los Institutos Centrales de Investigación de Bienestar Público (No. ZZ13-YQ-068; ZZ14-YQ-032; ZZ14-YQ-034; ZZ201914001; ZZ202017006; ZZ202017015).
Materials
| 4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | ThermoFisher | D3571 | |
| Confocal laser scanning microscope | Olympus | FV1200 | |
| Donkey anti-chicken AF488 | Jackson | 149973 (703-545-155) | |
| Donkey anti-goat AF546 | ThermoFisher | A11056 | |
| Donkey anti-rabbit AF488 | ThermoFisher | A21206 | |
| Donkey anti-rabbit AF546 | ThermoFisher | A10040 | |
| Frozen Section Medium | ThermoFisher | Neg-50 | Colorless |
| Microscope cover glass | Citotest | 10212450C | |
| Microtome | Yamato | REM-710 | |
| Neurofilament 200 | Sigma-Aldrich | N4142 | Rabbit |
| Neurofilament 200 | Abcam | ab4680 | Chicken |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 017-000-12 | 10 ml |
| Normal saline | Shandong Hualu Pharmaceutical Co.Ltd | H37022750 | 250 ml |
| Paraformaldehyde | Macklin | P804536 | 500g |
| Phalloidin AF350 | ThermoFisher | A22281 | |
| Precision peristaltic pump | Longer | BT100-2J | |
| S100-β | Abcam | ab52642 | Rabbit |
| Sodium phosphate dbasic dodecahydrate | Macklin | S818118 | 500g |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Macklin | S817463 | 500g |
| Sucrose | Macklin | S818046 | 500g |
| Superfrost plus microscope slides | ThermoFisher | 4951PLUS-001E | |
| Triton X-100 | Solarbio Life Sciences | 9002-93-1 | 100 ml |
| Vesicular Acetylcholine Transporter | Milipore | ANB100 | Goat |
| α-bungarotoxin AF647 conjugate | ThermoFisher | B35450 |
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