ラット内側腓腹筋における神経筋接合部の形態学的特徴の可視化
Summary
このプロトコールは、異なるバイオマーカー、すなわち、ニューロフィラメント200、小胞アセチルコリントランスポーター、α-バンガロトキシン、およびS100を有する蛍光免疫組織化学を用いて、ラット内側腓腹筋におけるシナプス前末端、シナプス後部受容体、およびシナプス周囲シュワン細胞間の空間的相関を調べる方法を示す。
Abstract
神経筋接合部(NMJ)は、運動ニューロンから骨格筋への信号伝達に役立つ複雑な構造であり、シナプス前運動軸索末端、シナプス後ニコチン性アセチルコリン受容体(AchRs)、およびシナプス周囲シュワン細胞(PSC)の3つの重要な組織学的構成要素からなる。NMJの形態学的特徴を実証するために、ラット内側腓腹筋を標的組織として選択し、運動神経線維およびそのシナプス前末端のためのニューロフィラメント200(NF200)および小胞アセチルコリントランスポーター(VAChT)、シナプス後ニコチン性AchRsのためのα−バンガロトキシン(α−BTX)を含む様々な種類のバイオマーカーによる多重蛍光染色を用いて調べ、 PSC の場合は S100 です。本試験では、第1群ではNF200、VAChT、およびα-BTXで染色し、第2群ではNF200、α-BTX、S100で染色した。両方のプロトコルがNMJの詳細な構造を効果的に実証できることが示された。共焦点顕微鏡を用いて、シナプス前末端、シナプス後受容体、PSCの形態学的特徴が見られ、それらのZスタック画像を3次元パターンで再構成し、異なる標識間の空間的相関をさらに解析した。方法論の観点から、これらのプロトコールは、生理学的条件下でのNMJの形態学的特徴を調査するための貴重な基準を提供し、末梢神経損傷および再生などのNMJの病理学的変化を評価するのにも適している可能性がある。
Introduction
神経筋接合部(NMJ)1,2,3,4の3つの必須構造成分として、シナプス前運動軸索末端の形態学的側面、ニコチン性アセチルコリン受容体(AchRs)、およびシナプス周囲シュワン細胞(PSC)を含むシナプス後膜が広範囲に研究されている。骨格筋の薄切片および全マウント標本は、電子顕微鏡5,6、共焦点顕微鏡7,8、および光シート顕微鏡9,10などの異なる組織学的技術を用いて検査されてきた。NMJの形態学的特徴は、異なる側面からこれらの技術によって実証されているが、比較として、共焦点顕微鏡はNMJの詳細な形態のイメージングのための理想的な選択肢である。
近年、NMJの構造成分を示すための多くの新しい技術が開発されている。例えば、thy1−YFPトランスジェニック蛍光マウスは、インビボおよびインビトロで運動軸索および運動エンドプレートを観察するために直接使用されている10、11。さらに、蛍光α-BTXの静脈内注射は、光シート顕微鏡による検査に組織光学クリアリング処理を使用することにより、野生型およびトランスジェニック蛍光マウスの全マウント骨格筋におけるモーターエンドプレートの空間分布を明らかにするために適用されている9,12。しかし、これらの高度な方法で見ることができるシナプス前部とシナプス後部の要素に加えて、PSCを同時に実証することはできません。
蓄積された証拠は、末梢グリア細胞としてのPSCが、NMJの発達および安定性、生理学的条件下でのNMJのシナプス活性の調節、および神経損傷後のNMJの再生に寄与するシナプス前末端と密接に関連していることを示している13、14、15.NMJの細胞構造を考慮すると、このプロトコルは、シナプス前部およびシナプス後部の要素であるPSCを同時に標識するための適切な候補であり、正常および病理学的条件下でのNMJの完全性および可塑性を評価するために潜在的に使用される。例えば、NMJの強度、シナプス後運動エンドプレートの形態および体積、NMJの神経支配および脱神経、ならびに生理学的および病理学的状態の筋肉におけるPSCの数を比較する。
腓腹筋はふくらはぎの膨らみを形成する最大の筋肉で、手足から皮膚や大腿二頭筋を取り除くことで簡単に解剖されます。筋肉は、しばしば、筋萎縮、神経筋変性、筋肉性能、および運動単位力をエキソビボまたはインビボで評価するために選択される16、17、18。しかし、この技術は、様々な骨格筋からNMJの形態学的特徴を明らかにするのにも適している。同時に、太い筋肉切片は、細い切片7、8およびからかわれた筋線維19と比較して、NMJのより完全な形態および量を明らかにすることができる。
これらの研究に沿って、ラット内側腓腹筋を本研究の標的組織として選択し、NMJの構造成分に従って様々な種類のバイオマーカーによる多重蛍光染色のために厚さ80μmでスライスした。ここで、ニューロフィラメント200(NF200)20、21、小胞性アセチルコリントランスポーター(VAChT)22、α−バンガロトキシン(α−BTX)23、24、およびS100 25,26を用いて、神経線維、シナプス前終末、シナプス後部AchRs、およびPSCをそれぞれ標識した。さらに、筋肉組織および細胞核の背景を、ファロイジンおよびDAPIでさらに対比染色した。
本研究では、NMJの細胞構造とそれに対応するバイオマーカーを、より厚い固定標本上で同時に染色するための洗練されたプロトコールを開発することが期待されており、これは共焦点顕微鏡での使用がより便利であり、PSCの詳細な構造、シナプス前部およびシナプス後部の要素、ならびにそれらの相互の空間的相関に関するより多くの情報を得るのに役立つ。方法論の観点から、このプロトコールは、正常および病理学的条件下でのNMJの形態学的特徴を評価するのに有益であり得る。
Protocol
Representative Results
Discussion
我々は、筋肉スライスの多重染色を成功させるために必要な技術的詳細と、ラット内側腓腹筋の厚い部分におけるNMJの形態学的特徴を明らかにするための蛍光免疫組織化学の使用について説明した。このアプローチを用いることにより、PSCおよびシナプス前後部要素の微細な詳細および空間的相関を共焦点顕微鏡下で分析および評価し、さらに3次元パターンで再構成することができる。ここ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、CACMSイノベーションファンド(No.CI2021A03407)、中国国家自然科学財団(第82004299号)、中央福祉研究所の基礎研究費(第1号。ZZ13-YQ-068;ZZ14-YQ-032;ZZ14-YQ-034;ZZ201914001;ZZ202017006;ZZ202017015)。
Materials
| 4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | ThermoFisher | D3571 | |
| Confocal laser scanning microscope | Olympus | FV1200 | |
| Donkey anti-chicken AF488 | Jackson | 149973 (703-545-155) | |
| Donkey anti-goat AF546 | ThermoFisher | A11056 | |
| Donkey anti-rabbit AF488 | ThermoFisher | A21206 | |
| Donkey anti-rabbit AF546 | ThermoFisher | A10040 | |
| Frozen Section Medium | ThermoFisher | Neg-50 | Colorless |
| Microscope cover glass | Citotest | 10212450C | |
| Microtome | Yamato | REM-710 | |
| Neurofilament 200 | Sigma-Aldrich | N4142 | Rabbit |
| Neurofilament 200 | Abcam | ab4680 | Chicken |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 017-000-12 | 10 ml |
| Normal saline | Shandong Hualu Pharmaceutical Co.Ltd | H37022750 | 250 ml |
| Paraformaldehyde | Macklin | P804536 | 500g |
| Phalloidin AF350 | ThermoFisher | A22281 | |
| Precision peristaltic pump | Longer | BT100-2J | |
| S100-β | Abcam | ab52642 | Rabbit |
| Sodium phosphate dbasic dodecahydrate | Macklin | S818118 | 500g |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Macklin | S817463 | 500g |
| Sucrose | Macklin | S818046 | 500g |
| Superfrost plus microscope slides | ThermoFisher | 4951PLUS-001E | |
| Triton X-100 | Solarbio Life Sciences | 9002-93-1 | 100 ml |
| Vesicular Acetylcholine Transporter | Milipore | ANB100 | Goat |
| α-bungarotoxin AF647 conjugate | ThermoFisher | B35450 |
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