Visualisera de morfologiska egenskaperna hos neuromuskulär korsning i råtta medial gastrocnemiusmuskel
Summary
Protokollet visar en metod för att undersöka rumslig korrelation mellan de presynaptiska terminalerna, postsynaptiska receptorerna och perisynaptiska Schwann-celler i råttamediala gastrocnemiusmuskeln med hjälp av fluorescerande immunohistokemi med olika biomarkörer, nämligen neurofilament 200, vesikulär acetylkolintransportör, alfa-bungarotoxin och S100.
Abstract
Den neuromuskulära korsningen (NMJ) är en komplex struktur som tjänar till signalkommunikationen från motorneuronen till skelettmuskeln och består av tre väsentliga histologiska komponenter: de presynaptiska motoraxonterminalerna, postsynaptiska nikotinacetylkolinreceptorer (AchRs) och peri-synaptiska Schwann-celler (PSC). För att demonstrera de morfologiska egenskaperna hos NMJ valdes den råtta mediala gastrocnemiusmuskeln som målvävnad och undersöktes med hjälp av flera fluorescerande färgning med olika typer av biomarkörer, inklusive neurofilament 200 (NF200) och vesikulär acetylkolintransportör (VAChT) för motornervfibrerna och deras presynaptiska terminaler, alfa-bungarotoxin (α-BTX) för postsynaptiska nikotiniska AchR, och S100 för PSC: erna. I denna studie utfördes färgning i två grupper: i den första gruppen färgades prover med NF200, VAChT och α-BTX, och i den andra gruppen färgades prover med NF200, α-BTX och S100. Det visades att båda protokollen effektivt kan visa nmj:s detaljerade struktur. Med hjälp av konfokalmikroskopet sågs morfologiska egenskaper hos de presynaptiska terminalerna, postsynaptiska receptorerna och PSC, och deras Z-stacksbilder rekonstruerades i ett tredimensionellt mönster för att ytterligare analysera den rumsliga korrelationen mellan de olika märkningarna. Ur metodologiskt perspektiv ger dessa protokoll en värdefull referens för att undersöka de morfologiska egenskaperna hos NMJ under fysiologiska förhållanden, vilket också kan vara lämpligt för att utvärdera den patologiska förändringen av NMJ, såsom perifer nervskada och regenerering.
Introduction
Som tre väsentliga strukturella komponenter i den neuromuskulära korsningen (NMJ)1,2,3,4 har morfologiska aspekter av de presynaptiska motoraxonterminalerna, postsynaptiska membran innehållande nikotinacetylkolinreceptorer (AchRs) och perisynaptiska Schwann-celler (PSC) undersökts omfattande. Tunna sektioner och helmonterade prover av skelettmusklerna har undersökts med olika histologiska tekniker, såsom elektronmikroskopi 5,6, konfokalmikroskopi 7,8 och ljusplåtsmikroskopi 9,10. Även om de morfologiska egenskaperna hos NMJ har demonstrerats av dessa tekniker från olika aspekter, som en jämförelse, är konfokalmikroskopi fortfarande ett idealiskt val för avbildning av NMJ: s detaljerade morfologi.
Nyligen har många nya tekniker utvecklats för att visa de strukturella komponenterna i NMJ. Till exempel har thy1-YFP transgena fluorescerande möss använts direkt för att observera motoraxoner och motorändplattor in vivo och in vitro10,11. Dessutom har intravenös injektion av fluorescerande α-BTX tillämpats för att avslöja den rumsliga fördelningen av motorändplattor i helmonterade skelettmuskler av vildtyp och transgen fluorescerande möss, genom att använda vävnadsoptisk clearingbehandling för undersökning med ljusplåtmikroskopi 9,12. Men förutom de pre- och postsynaptiska elementen som kan ses med dessa avancerade metoder kan PSC: erna inte demonstreras samtidigt.
Ackumulerande bevis tyder på att PSC, som de perifera glialcellerna, är nära associerade med de presynaptiska terminalerna som bidrar till utvecklingen och stabiliteten hos NMJ, moduleringen av synaptisk aktivitet hos NMJ under det fysiologiska tillståndet och regenereringen av NMJ efter nervskada 13,14,15 . Med tanke på NMJ: s cellulära arkitektur är detta protokoll en korrekt kandidat för att samtidigt märka PSC: erna, pre- och postsynaptiska element, och används potentiellt för att utvärdera NMJ: s integritet och plasticitet under normala och patologiska förhållanden. Jämför till exempel intensiteten hos NMJ, morfologi och volym av postsynaptiska motoriska ändplattor, innervation och denervation av NMJ och antal PSC i muskler med fysiologisk och patologisk status.
Gastrocnemiusmuskeln är den största muskeln som bildar utbuktningen i vaden, som lätt dissekeras ut genom att ta bort huden och biceps femoris-muskeln från lemmen. Muskeln väljs ofta för att bedöma muskelatrofi, neuromuskulär degeneration, muskelprestanda och motorenhetskraft ex vivo eller in vivo16,17,18. Tekniken är emellertid också lämplig för att avslöja de morfologiska egenskaperna hos NMJ från olika skelettmuskler. Samtidigt kan de tjocka muskelsektionerna avslöja mer fullständig morfologi och mängd NMJ jämfört med tunna sektioner 7,8 och retade muskelfibrer19.
I linje med dessa studier valdes den råtta mediala gastrocnemiusmuskeln som målvävnad i denna studie och skivades med en tjocklek av 80 μm för multipel fluorescerande färgning med olika typer av biomarkörer enligt de strukturella komponenterna i NMJ. Här användes neurofilament 200 (NF200)20,21, vesikulär acetylkolintransportör (VAChT)22, alfa-bungarotoxin (α-BTX)23,24 och S10025,26 för att märka nervfibrer, presynaptiska terminaler, postsynaptiska AchR respektive PSC. Dessutom motverkades bakgrunden av muskelvävnad och cellulära kärnor ytterligare med falloidin och DAPI.
I denna studie förväntar vi oss att utveckla ett raffinerat protokoll för att samtidigt färga NMJ: s cellulära arkitektur med deras motsvarande biomarkörer på tjockare fasta prover, vilket är bekvämare för användning i konfokalmikroskopi och hjälper till att få mycket mer information om den detaljerade strukturen hos PSC: erna, pre- och postsynaptiska element, liksom deras rumsliga korrelation med varandra. Ur metodologisk synvinkel kan detta protokoll dra nytta av att utvärdera de morfologiska egenskaperna hos NMJ under normala och patologiska förhållanden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har beskrivit de tekniska detaljer som krävs för att utföra framgångsrik multipel färgning av muskelskivor och användning av fluorescerande immunohistokemi för att avslöja de morfologiska egenskaperna hos NMJ på de tjocka delarna av råttans mediala gastrocnemiusmuskel. Genom att använda detta tillvägagångssätt kan de fina detaljerna och den rumsliga korrelationen mellan PSC: erna och pre- och postsynaptiska element analyseras och uppskattas under konfokalmikroskopi och rekonstrueras ytterligare i ett tre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie finansierades av CACMS Innovation Fund (nr. CI2021A03407), National Natural Science Foundation of China (nr 82004299) och grundforskningsfonderna för de centrala offentliga välfärdsforskningsinstituten (nr. ZZ13-YQ-068; ZZ14-YQ-032; ZZ14-YQ-034; ZZ201914001; ZZ202017006; ZZ202017015).
Materials
| 4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | ThermoFisher | D3571 | |
| Confocal laser scanning microscope | Olympus | FV1200 | |
| Donkey anti-chicken AF488 | Jackson | 149973 (703-545-155) | |
| Donkey anti-goat AF546 | ThermoFisher | A11056 | |
| Donkey anti-rabbit AF488 | ThermoFisher | A21206 | |
| Donkey anti-rabbit AF546 | ThermoFisher | A10040 | |
| Frozen Section Medium | ThermoFisher | Neg-50 | Colorless |
| Microscope cover glass | Citotest | 10212450C | |
| Microtome | Yamato | REM-710 | |
| Neurofilament 200 | Sigma-Aldrich | N4142 | Rabbit |
| Neurofilament 200 | Abcam | ab4680 | Chicken |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 017-000-12 | 10 ml |
| Normal saline | Shandong Hualu Pharmaceutical Co.Ltd | H37022750 | 250 ml |
| Paraformaldehyde | Macklin | P804536 | 500g |
| Phalloidin AF350 | ThermoFisher | A22281 | |
| Precision peristaltic pump | Longer | BT100-2J | |
| S100-β | Abcam | ab52642 | Rabbit |
| Sodium phosphate dbasic dodecahydrate | Macklin | S818118 | 500g |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Macklin | S817463 | 500g |
| Sucrose | Macklin | S818046 | 500g |
| Superfrost plus microscope slides | ThermoFisher | 4951PLUS-001E | |
| Triton X-100 | Solarbio Life Sciences | 9002-93-1 | 100 ml |
| Vesicular Acetylcholine Transporter | Milipore | ANB100 | Goat |
| α-bungarotoxin AF647 conjugate | ThermoFisher | B35450 |
References
- Kawabuchi, M., et al. The spatiotemporal relationship among Schwann cells, axons and postsynaptic acetylcholine receptor regions during muscle reinnervation in aged rats. TheAnatomical Record. 264 (2), 183-202 (2001).
- Nishimune, H., Shigemoto, K. Practical anatomy of the neuromuscular junction in health and disease. Neurologic Clinics. 36 (2), 231-240 (2018).
- Guarino, S. R., Canciani, A., Forneris, F. Dissecting the extracellular complexity of neuromuscular junction organizers. Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 156 (2020).
- Cruz, P. M. R., Cossins, J., Beeson, D., Vincent, A. The neuromuscular junction in health and disease: molecular mechanisms governing synaptic formation and homeostasis. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 610964 (2020).
- Matthews-Bellinger, J., Salpeter, M. Fine structural distribution of acetylcholine receptors at developing mouse neuromuscular junctions. The Journal of Neuroscienc : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 3 (3), 644-657 (1983).
- Desaki, J., Uehara, Y. Formation and maturation of subneural apparatuses at neuromuscular junctions in postnatal rats: a scanning and transmission electron microscopical study. 발생학. 119 (2), 390-401 (1987).
- Marques, M., Santo Neto, H. Imaging neuromuscular junctions by confocal fluorescence microscopy: individual endplates seen in whole muscles with vital intracellular staining of the nerve terminals. Journal of Anatomy. 192, 425-430 (1998).
- Magill, C. K., et al. Reinnervation of the tibialis anterior following sciatic nerve crush injury: a confocal microscopic study in transgenic mice. Experimental Neurology. 207 (1), 64-74 (2007).
- Yin, X., et al. Spatial distribution of motor endplates and its adaptive change in skeletal muscle. Theranostics. 9 (3), 734-746 (2019).
- Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Chen, W. T., et al. In vivo injection of -bungarotoxin to improve the efficiency of motor endplate labeling. Brain and Behavior. 6 (6), 00468 (2016).
- Sugiura, Y., Lin, W. Neuron-glia interactions: the roles of Schwann cells in neuromuscular synapse formation and function. Bioscience Reports. 31 (5), 295-302 (2011).
- Alvarez-Suarez, P., Gawor, M., Proszynski, T. J. Perisynaptic schwann cells – The multitasking cells at the developing neuromuscular junctions. Seminars in Cell & Developmental Biology. 104, 31-38 (2020).
- Walker, C. L. Progress in perisynaptic Schwann cell and neuromuscular junction research. Neural Regeneration Research. 17 (6), 1273-1274 (2022).
- Michaud, M., et al. Neuromuscular defects and breathing disorders in a new mouse model of spinal muscular atrophy. Neurobiology of Disease. 38 (1), 125-135 (2010).
- Sharma, S., et al. Heat-induced endoplasmic reticulum stress in soleus and gastrocnemius muscles and differential response to UPR pathway in rats. Cell Stress Chaperones. 26 (2), 323-339 (2021).
- Raikova, R., Celichowski, J., Angelova, S., Krutki, P. A model of the rat medial gastrocnemius muscle based on inputs to motoneurons and on an algorithm for prediction of the motor unit force. Journal of Neurophysiology. 120 (4), 1973-1987 (2018).
- Marinello, M., et al. Characterization of neuromuscular junctions in mice by combined confocal and super-resolution microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (178), e63032 (2021).
- Perrot, R., Berges, R., Bocquet, A., Eyer, J. Review of the multiple aspects of neurofilament functions, and their possible contribution to neurodegeneration. Molecular Neurobiology. 38 (1), 27-65 (2008).
- Yuan, A., Rao, M. V., Nixon, R. A. Neurofilaments and neurofilament proteins in health and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (4), 018309 (2017).
- Petrov, K. A., Proskurina, S. E., Krejci, E. Cholinesterases in tripartite neuromuscular synapse. Frontiers in Molecular Neuroscience. 14, 811220 (2021).
- Karlin, A. Emerging structure of the nicotinic acetylcholine receptors. Nature Reviews. Neuroscience. 3 (2), 102-114 (2002).
- Rudolf, R., Straka, T. Nicotinic acetylcholine receptor at vertebrate motor endplates: Endocytosis, recycling, and degradation. Neuroscience Letters. 711, 134434 (2019).
- Barik, A., Li, L., Sathyamurthy, A., Xiong, W. C., Mei, L. Schwann cells in neuromuscular junction formation and maintenance. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 36 (38), 9770-9781 (2016).
- Kang, H., Tian, L., Thompson, W. J. Schwann cell guidance of nerve growth between synaptic sites explains changes in the pattern of muscle innervation and remodeling of synaptic sites following peripheral nerve injuries. Journal of Comparative Neurology. 527 (8), 1388-1400 (2019).
- Wang, J., et al. A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).
- Hughes, B. W., Kusner, L. L., Kaminski, H. J. Molecular architecture of the neuromuscular junction. Muscle Nerve. 33 (4), 445-461 (2006).
- Boehm, I., et al. Comparative anatomy of the mammalian neuromuscular junction. Journal of Anatomy. 237 (5), 827-836 (2020).
