التصوير غير الجراحي PET / MR في نموذج فأر تقويمي لسرطان الخلايا الكبدية
Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا لإنشاء سرطان الخلايا الكبدية xenografts مع وبدون ربط الشريان الكبدي وإجراء التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني غير الغازية (PET) لنقص الأكسجة في الورم باستخدام [18 F] Fluoromisonidazole ([18 F] FMISO) و [18 F] Fluorodeoxyglucose ([18F] FDG).
Abstract
تمثل النماذج التجريبية قبل السريرية لسرطان الخلايا الكبدية (HCC) التي تلخص الأمراض البشرية أداة مهمة لدراسة تكوين الورم وتقييم الأساليب العلاجية الجديدة. يوفر التصوير غير الجراحي لكامل الجسم باستخدام التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET) رؤى مهمة حول الخصائص في الجسم الحي للأنسجة على المستوى الجزيئي في الوقت الفعلي. نقدم هنا بروتوكولا لإنشاء xenograft لتقويم سرطان الكبد مع وبدون ربط الشريان الكبدي (HAL) للحث على نقص الأكسجة في الورم وتقييم استقلاب الورم في الجسم الحي باستخدام [18 F] فلوروميسونيدازول ([18 F] FMISO) و [18 F] فلوروديوكسي جلوكوز ([18F] FDG) التصوير بالرنين المقطعي بالإصدار البوزيتروني / الرنين المغناطيسي (MR). يمكن تصور نقص الأكسجة في الورم بسهولة باستخدام علامة نقص الأكسجة [18 F] FMISO ، ووجد أن امتصاص [18 F] FMISO كان أعلى في الفئران HCC التي خضعت ل HAL مقارنة بالمجموعة غير HAL ، في حين أن [18F] FDG لم يستطع التمييز بين نقص الأكسجة في الورم بين المجموعتين. أظهرت أورام HAL أيضا مستوى أعلى من تعبير العامل المحرض لنقص الأكسجة (HIF) -1α استجابة لنقص الأكسجة. أظهر القياس الكمي لأورام HAL زيادة بمقدار 2.3 ضعف في امتصاص [18F] FMISO بناء على نهج امتصاص القيمة الموحدة (SUV).
Introduction
سرطان الخلايا الكبدية (HCC) هو سادس أكثر أنواع السرطان تشخيصا وثالث أكثر أسباب الوفاة شيوعا بسبب السرطان في جميع أنحاء العالم ، مع أكثر من 900,000 حالة جديدة و 800,000 حالة وفاة في عام 20201. عامل الخطر الرئيسي هو تليف الكبد ، والذي يحدث نتيجة للعدوى الفيروسية (فيروسات التهاب الكبد B و C) ، وتعاطي الكحول ، ومرض السكري ، والتهاب الكبد الدهني غير الكحولي2. إدارة سرطان الكبد معقدة إلى حد ما ، وتتوفر العديد من خيارات العلاج ، بما في ذلك الاستئصال الجراحي ، والاستئصال الحراري أو الكيميائي ، والزرع ، والانصمام الكيميائي عبر الشرايين ، والإشعاع ، والعلاج الكيميائي ، اعتمادا على مرحلة المرض 2,3. سرطان الكبد هو ورم مقاوم للعلاج الكيميائي مع تكرار المرض في ما يصل إلى 70 ٪ من المرضى بعد العلاج العلاجي2.
على الرغم من الدرجة العالية من عدم تجانس الورم ، يرتبط سرطان الكبد بنتيجتين شائعتين: (i) سرطان الكبد هو نقص الأكسجين للغاية ، و (ii) يرتبط نقص الأكسجة في الورم بزيادة عدوانية الورم وفشل العلاج. يؤدي الانتشار غير المنضبط لخلايا سرطان الكبد إلى ارتفاع معدل استهلاك الأكسجين الذي يسبق الأوعية الدموية ، مما يخلق بيئة دقيقة ناقصة الأكسجين. ثم يؤدي انخفاض مستويات الأكسجين داخل الورم إلى مجموعة من الاستجابات البيولوجية التي تؤثر على عدوانية الورم والاستجابة للعلاج. غالبا ما يتم التعرف على العوامل المسببة لنقص الأكسجة (HIFs) على أنها منظمات النسخ الأساسية في الاستجابة لنقص الأكسجة 2,3. وبالتالي ، فإن القدرة على اكتشاف نقص الأكسجة أمر بالغ الأهمية لتصور أنسجة الأورام وتحديد المواقع التي يتعذر الوصول إليها ، والتي تتطلب إجراءات غازية. كما أنه يساعد على فهم أفضل للتغيرات الجزيئية التي تؤدي إلى عدوانية الورم وتحسين نتائج علاج المريض.
يشيع استخدام التصوير الجزيئي باستخدام التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET) في تشخيص العديد من أنواع السرطان وتحديد مراحلها ، بما في ذلك سرطان الكبد. على وجه الخصوص ، يمكن أن يؤدي الاستخدام المشترك لتصوير PET ثنائي التتبع الذي يتضمن [18 F] Fluorodeoxyglucose ([18F] FDG) و [11C] Acetate إلى زيادة الحساسية الكلية بشكل كبير في تشخيص سرطان الكبد 4,5. من ناحية أخرى ، يمكن تحقيق تصوير نقص الأكسجة باستخدام علامة نقص الأكسجين شائعة الاستخدام [18 F] فلوروميزونيدازول ([18F] FMISO). في الممارسة السريرية ، يعد التقييم غير الجراحي لنقص الأكسجة مهما للتمييز بين أنواع مختلفة من الأورام والمناطق لتخطيط العلاج الإشعاعي6.
أصبح التصوير قبل السريري أداة لا غنى عنها للتقييم غير الجراحي والطولي لنماذج الفئران للأمراض المختلفة. يمثل نموذج سرطان الكبد القوي والقابل للتكرار بدرجة كبيرة منصة مهمة للبحوث قبل السريرية والانتقالية في الفيزيولوجيا المرضية لسرطان الكبد البشري وتقييم العلاجات الجديدة. جنبا إلى جنب مع التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني ، يمكن توضيح السلوكيات في الجسم الحي لتوفير رؤى مهمة على المستوى الجزيئي لأي نقطة زمنية معينة. هنا ، نصف بروتوكولا لتوليد الطعوم الخارجية لربط الشريان الكبدي (HAL) وتحليل استقلاب الورم في الجسم الحي باستخدام [18 F] FMISO و [18F] FDG PET / MR. إن دمج HAL يجعل نموذجا مناسبا لطعوم الفئران المعدلة وراثيا أو المستحثة كيميائيا لدراسة نقص الأكسجة في الورم في الجسم الحي ، حيث يمكن ل HAL أن يمنع بشكل فعال إمداد الدم الشرياني للحث على نقص الأكسجة داخل الورم 7,8. بالإضافة إلى ذلك ، على عكس التلوين الكيميائي المناعي خارج الجسم الحي باستخدام بيمونيدازول ، يمكن تصور التغيرات في استقلاب الورم نتيجة لنقص الأكسجة بسهولة وقياسها بدقة غير جراحية باستخدام التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني ، مما يتيح التقييم الطولي لاستجابة العلاج أو قياس ظهور المقاومة3،7،8 . تسمح طريقتنا الموضحة هنا بإنشاء نموذج قوي لنقص الأكسجين في سرطان الكبد جنبا إلى جنب مع المراقبة غير الغازية لنقص الأكسجة في الورم باستخدام التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني / التصوير بالرنين المغناطيسي لدراسة بيولوجيا سرطان الكبد في الجسم الحي.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الدراسة ، وصفنا إجراءات إجراء HAL على الطعوم الخارجية لسرطان الكبد التقويمي باستخدام الأورام تحت الجلد ، جنبا إلى جنب مع طرق المراقبة غير الغازية لنقص الأكسجة في الورم في الطعوم الخارجية التقويمية باستخدام [18 F] FMISO و [18F] FDG PET / MR. يكمن اهتمامنا في التصوير الأيضي لمختلف نماذ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن نقر بدعم الصندوق الاستئماني لمكافحة السرطان في هونغ كونغ ، صندوق البحوث التعاونية لمجلس هونغ كونغ للمنح البحثية (CRF C7018-14E) لتجارب تصوير الحيوانات الصغيرة. كما نشكر دعم مركز التصوير الجزيئي والسيكلوترون الطبي (MIMCC) في جامعة هونغ كونغ لتوفير [18 F] FMISO و [18F] FDG.
Materials
| 0.9% sterile saline | BBraun | N/A | 0.9% sodium chloride intravenous infusion, 500 mL |
| 10# Scalpel blade | RWD Life Science Co.,ltd | S31010-01 | Animal surgery tool |
| 10% povidone-iodine solution | Banitore | 6.425.678 | For disinfection |
| 25G needle with a 1 mL syringe | BD PrecisionGlide | N/A | 1 mL syringe with 25G needle for cell suspensions injections |
| 5 mL syringe | Terumo | SS05L | 5 mL syringe Luer Lock |
| 70% Ethanol | Merck | 1.07017 | For disinfection |
| Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF2000 | For automated cell counting |
| Buprenorphine | HealthDirect | N/A | Subcutaneous injection (0.05-0.2 mg/kg/12 hours) for analgesic after surgery |
| Cell Culture Dish (60 mm diameter) | Thermo Scientific | 150462 | For tumor tissue processing |
| Centrifuge | Sigma | 3-16KL, fixed-angle rotor 12311 | For cell suspensions collection |
| Centrifuge Conical Tube | Eppendorf | EP0030122151 | For cell suspensions collection |
| Culture media (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) | Gibco | 10566024 | high glucose, GlutaMAX™ Supplement |
| Digital Caliper | RS PRO | 841-2518 | For subcutaneous tumor size measurement |
| Direct heat CO2 incubator | Techcomp Limited | NU5841 | For cell culture |
| Dose calibrator | Biodex | N/A | Atomlab 500 |
| DPBS (Dulbecco’s phosphate-buffered saline) | Gibco | 14287072 | For cell wash and injection |
| Eye lubricant | Alcon Duratears | N/A | Sterile ocular lubricant ointment, 3.5 g |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | A4766801 | Used for a broad range of cell types, especially sensitive cell lines |
| Forceps (curved fine and straight blunt) | RWD Life Science Co.,ltd | F12012-10 & F12011-13 | Animal surgery tool |
| Heating pad | ALA Scientific Instruments | N/A | Heat pad for mice during surgery |
| Insulin syringe | Terumo | 10ME2913 | 1 mL insulin syringe with needle for radiotracer injections |
| InterView fusion software | Mediso | Version 3.03 | Post-processing and image analysis software |
| Inverted microscope | Yu Lung Scientific Co., Ltd | BM-209G | For cells morphology visualization |
| Isoflurane | Chanelle Pharma | N/A | Iso-Vet, inhalation anesthetic, 250 mL |
| Ketamine | Alfasan International B.V. | HK-37715 | Ketamine 10% injection solution, 10 mL |
| Medical oxygen | Linde HKO | 101-HR | compressed gas, 99.5% purity |
| nanoScan PET/MR Scanner | Mediso | N/A | 3 Tesla MR |
| Needle holder | RWD Life Science Co.,ltd | F31026-12 | Animal surgery tool |
| Nucline nanoScan software | Mediso | Version 3.0 | Scanner operating software |
| Nylon Suture (6/0 and 5/0) | Healthy Medical Company Ltd | 000524 & 000526 | Animal surgery tool |
| Penicillin- Streptomycin | Gibco | 15140122 | Culture media for a final concentration of 50 to 100 I.U./mL penicillin and 50 to 100 µg/mL streptomycin. |
| Pentabarbital | AlfaMedic | 13003 | Intraperitoneal injection (330 mg/kg) to induce cessation of breathing of mice |
| Sharp scissors | RWD Life Science Co.,ltd | S14014-10 | Animal surgery tool |
| Spring Scissors | RWD Life Science Co.,ltd | S11005-09 | Animal surgery tool |
| Trypan Blue Solution, 0,4% | Gibco | 15250061 | For cell counting |
| Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, 0.25%), phenol red. | Gibco | 25200072 | For cell digestion |
| Xylazine | Alfasan International B.V. | HK-56179 | Xylazine 2% injection solution, 30 mL |
References
- Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
- Chen, C., Lou, T. Hypoxia inducible factors in hepatocellular carcinoma. Oncotarget. 8 (28), 46691-46703 (2017).
- Lu, R. -. C., et al. Positron-emission tomography for hepatocellular carcinoma: Current status and future prospects. World Journal of Gastroenterology. 25 (32), 4682-4695 (2019).
- Larsson, P., et al. Adding 11C-acetate to 18F-FDG at PET examination has an incremental value in the diagnosis of hepatocellular carcinoma. Molecular Imaging and Radionuclide Therapy. 21 (1), 6-12 (2012).
- Huo, L., et al. Kinetic analysis of dynamic 11C-acetate PET/CT imaging as a potential method for differentiation of hepatocellular carcinoma and benign liver lesions. Theranostics. 5 (4), 371-377 (2015).
- Lopci, E., et al. PET radiopharmaceuticals for imaging of tumor hypoxia: A review of the evidence. American Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 4 (4), 365-384 (2014).
- Mao, X., et al. Mechanisms through which hypoxia-induced caveolin-1 drives tumorigenesis and metastasis in hepatocellular carcinoma. 암 연구학. 76 (24), 7242-7253 (2016).
- Kung-Chun Chiu, D., et al. Hypoxia regulates the mitochondrial activity of hepatocellular carcinoma cells through HIF/HEY1/PINK1 pathway. Cell Death & Disease. 10 (12), 934 (2019).
- Li, Y., et al. Establishment of cell clones with different metastatic potential from the metastatic hepatocellular carcinoma cell line MHCC97. World Journal of Gastroenterology. 7 (5), 630-636 (2001).
- Faustino-Rocha, A., et al. Estimation of rat mammary tumor volume using caliper and ultrasonography measurements. Lab Animal. 42 (6), 217-224 (2013).
- Liu, Q., Tan, K. V., Chang, H. C., Khong, P. L., Hui, X. Visualization and quantification of brown and beige adipose tissues in mice using [18F] FDG micro-PET/MR imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (173), e62460 (2021).
- Lin, W. -. H., et al. Hypoxia-activated cytotoxic agent tirapazamine enhances hepatic artery ligation-induced killing of liver tumor in HBx transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (42), 11937-11942 (2016).
- Wong, T. L., et al. CRAF methylation by PRMT6 regulates aerobic glycolysis-driven hepatocarcinogenesis via ERK-dependent PKM2 nuclear relocalization and activation. Hepatology. 71 (4), 1279-1296 (2020).
- Yang, X., et al. Development of cisplatin-loaded hydrogels for trans-portal vein chemoembolization in an orthotopic liver cancer mouse model. Drug Delivery. 28 (1), 520-529 (2021).
- Shi, J., et al. Longitudinal evaluation of five nasopharyngeal carcinoma animal models on the microPET/MR platform. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 49 (5), 1497-1507 (2021).
- Kilian, K., et al. Imaging of hypoxia in small animals with F fluoromisonidasole. Nukleonika. 61 (2), 219-223 (2016).
- Kawamura, M., et al. Evaluation of optimal post-injection timing of hypoxic imaging with 18F-Fluoromisonidazole-PET/CT. Molecular Imaging and Biology. 23 (4), 597-603 (2021).
