Her præsenterer vi en protokol til oprettelse af ortotopiske hepatocellulære carcinomxenotransplantater med og uden leverarterieligering og udfører ikke-invasiv positronemissionstomografi (PET) billeddannelse af tumorhypoxi ved hjælp af [18 F] Fluoromisonidazol ([18 F] FMISO) og [18 F] fluorodeoxyglucose ([18F] FDG).
Prækliniske eksperimentelle modeller af hepatocellulært carcinom (HCC), der rekapitulerer menneskelig sygdom, repræsenterer et vigtigt redskab til at studere tumorigenese og evaluere nye terapeutiske tilgange. Ikke-invasiv helkropsbilleddannelse ved hjælp af positronemissionstomografi (PET) giver kritisk indsigt i vævets in vivo-egenskaber på molekylært niveau i realtid. Vi præsenterer her en protokol for ortotopisk HCC-xenograftdannelse med og uden leverarterieligering (HAL) for at inducere tumorhypoxi og vurderingen af deres tumormetabolisme in vivo ved anvendelse af [18 F] Fluoromisonidazol ([18 F] FMISO) og [18 F] Fluorodeoxyglucose ([18F] FDG) PET / magnetisk resonans (MR) billeddannelse. Tumorhypoxi kunne let visualiseres ved hjælp af hypoxi-markøren [18 F] FMISO, og det blev fundet, at [18 F] FMISO-optagelsen var højere hos HCC-mus, der gennemgik HAL end i ikke-HAL-gruppen, mens [18F] FDG ikke kunne skelne tumorhypoxi mellem de to grupper. HAL-tumorer viste også et højere niveau af hypoxi-inducerbar faktor (HIF)-1α-ekspression som reaktion på hypoxi. Kvantificering af HAL-tumorer viste en 2,3 gange stigning i [18F] FMISO-optagelse baseret på den standardiserede værdioptagelsesmetode (SUV).
Hepatocellulært karcinom (HCC) er den sjette mest diagnosticerede kræft og den tredje mest almindelige dødsårsag fra kræft på verdensplan med mere end 900,000 nye tilfælde og 800,000 dødsfald i 20201. Den største risikofaktor er skrumpelever, der opstår som følge af virusinfektioner (hepatitis B- og C-vira), alkoholmisbrug, diabetes og ikke-alkoholisk steatohepatitis2. Håndteringen af HCC er ret kompleks, og flere behandlingsmuligheder er tilgængelige, herunder kirurgisk resektion, termisk eller kemisk ablation, transplantation, transarteriel kemoembolisering, stråling og kemoterapi, afhængigt af sygdomsstadiet 2,3. HCC er en kemoterapi-ildfast tumor med sygdomstilbagefald hos op til 70% af patienterne efter helbredende hensigtterapi 2.
På trods af den høje grad af tumorheterogenitet er HCC forbundet med to almindelige resultater: (i) HCC er meget hypoxisk, og (ii) tumorhypoxi er forbundet med større tumoraggressivitet og behandlingssvigt. Den ukontrollerede spredning af HCC-celler resulterer i et højt iltforbrug, der går forud for vaskularisering, hvilket skaber et hypoxisk mikromiljø. Lave intratumorale iltniveauer udløser derefter en række biologiske reaktioner, der påvirker tumoraggressivitet og behandlingsrespons. Hypoxi-inducerbare faktorer (HIF’er) anerkendes ofte som de væsentlige transkriptionelle regulatorer som reaktion på hypoxi 2,3. Derfor er evnen til at detektere hypoxi afgørende for at visualisere neoplastisk væv og identificere de utilgængelige steder, som kræver invasive procedurer. Det hjælper også til bedre at forstå de molekylære ændringer, der fører til tumoraggressivitet og forbedrer patientbehandlingsresultaterne.
Molekylær billeddannelse ved hjælp af positronemissionstomografi (PET) anvendes almindeligvis til diagnosticering og iscenesættelse af mange kræftformer, herunder HCC. Navnlig kan kombineret anvendelse af dobbeltsporet PET-billeddannelse, der involverer [18 F]fluorodeoxyglucose ([18F]FDG) og [11C]acetat, øge den samlede følsomhed ved HCC-diagnose 4,5 betydeligt. Billeddannelse af hypoxi kan derimod opnås ved anvendelse af den almindeligt anvendte hypoxiske markør [18 F]Fluoromisonidazol ([18F]FMISO). I klinisk praksis er den ikke-invasive vurdering af hypoxi vigtig for at skelne mellem forskellige typer tumorer og regioner til planlægning af strålebehandling6.
Præklinisk billeddannelse er blevet et uundværligt værktøj til ikke-invasiv og langsgående evaluering af musemodeller for forskellige sygdomme. En robust og meget reproducerbar HCC-model udgør en vigtig platform for præklinisk og translationel forskning i patofysiologien af humant HCC og vurdering af nye terapier. Sammen med PET-billeddannelse kan in vivo-adfærd belyses for at give vigtig indsigt på molekylært niveau for et givet tidspunkt. Her beskriver vi en protokol til generering af hepatisk arterieligering (HAL) ortopisk HCC-xenotransplantater og analyse af deres in vivo tumormetabolisme ved hjælp af [18 F] FMISO og [18F] FDG PET / MR. Inkorporeringen af HAL gør en passende model af transgene eller kemisk inducerede HCC-mus xenotransplantater til at studere tumorhypoxxi in vivo, da HAL effektivt kan blokere arteriel blodforsyning for at inducere intratumoral hypoxi 7,8. I modsætning til ex vivo immunhistokemisk farvning ved anvendelse af pimonidazol kan ændringer i tumormetabolisme som følge af hypoxi desuden let visualiseres og nøjagtigt kvantificeres ikke-invasivt ved hjælp af PET-billeddannelse, hvilket muliggør langsgående vurdering af behandlingsrespons eller måling af fremkomsten af resistens 3,7,8 . Vores metode, der er vist her, gør det muligt at skabe en robust hypoxisk HCC-model sammen med ikke-invasiv overvågning af tumorhypoxi ved hjælp af PET/MR-billeddannelse til at studere HCC-biologi in vivo.
I denne undersøgelse beskrev vi procedurerne for udførelse af HAL på leverortotopiske HCC-xenotransplantater ved hjælp af subkutane tumorer sammen med metoder til ikke-invasiv overvågning af tumorhypoxxxi i ortotopiske xenotransplantater ved hjælp af [18 F] FMISO og [18F] FDG PET / MR. Vores interesse ligger i metabolisk billeddannelse af forskellige kræft- og sygdomsmodeller til tidlig diagnose og evaluering af behandlingsrespons11,13,14,15<sup class="xref"…
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkender støtten fra Hong Kong Anticancer Trust Fund, Hong Kong Research Grants Council Collaborative Research Fund (CRF C7018-14E) til billeddannelsesforsøg med små dyr. Vi takker også støtten fra Molecular Imaging and Medical Cyclotron Center (MIMCC) ved University of Hong Kong for levering af [18 F] FMISO og [18F] FDG.
0.9% sterile saline | BBraun | N/A | 0.9% sodium chloride intravenous infusion, 500 mL |
10# Scalpel blade | RWD Life Science Co.,ltd | S31010-01 | Animal surgery tool |
10% povidone-iodine solution | Banitore | 6.425.678 | For disinfection |
25G needle with a 1 mL syringe | BD PrecisionGlide | N/A | 1 mL syringe with 25G needle for cell suspensions injections |
5 mL syringe | Terumo | SS05L | 5 mL syringe Luer Lock |
70% Ethanol | Merck | 1.07017 | For disinfection |
Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF2000 | For automated cell counting |
Buprenorphine | HealthDirect | N/A | Subcutaneous injection (0.05-0.2 mg/kg/12 hours) for analgesic after surgery |
Cell Culture Dish (60 mm diameter) | Thermo Scientific | 150462 | For tumor tissue processing |
Centrifuge | Sigma | 3-16KL, fixed-angle rotor 12311 | For cell suspensions collection |
Centrifuge Conical Tube | Eppendorf | EP0030122151 | For cell suspensions collection |
Culture media (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) | Gibco | 10566024 | high glucose, GlutaMAX™ Supplement |
Digital Caliper | RS PRO | 841-2518 | For subcutaneous tumor size measurement |
Direct heat CO2 incubator | Techcomp Limited | NU5841 | For cell culture |
Dose calibrator | Biodex | N/A | Atomlab 500 |
DPBS (Dulbecco’s phosphate-buffered saline) | Gibco | 14287072 | For cell wash and injection |
Eye lubricant | Alcon Duratears | N/A | Sterile ocular lubricant ointment, 3.5 g |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | A4766801 | Used for a broad range of cell types, especially sensitive cell lines |
Forceps (curved fine and straight blunt) | RWD Life Science Co.,ltd | F12012-10 & F12011-13 | Animal surgery tool |
Heating pad | ALA Scientific Instruments | N/A | Heat pad for mice during surgery |
Insulin syringe | Terumo | 10ME2913 | 1 mL insulin syringe with needle for radiotracer injections |
InterView fusion software | Mediso | Version 3.03 | Post-processing and image analysis software |
Inverted microscope | Yu Lung Scientific Co., Ltd | BM-209G | For cells morphology visualization |
Isoflurane | Chanelle Pharma | N/A | Iso-Vet, inhalation anesthetic, 250 mL |
Ketamine | Alfasan International B.V. | HK-37715 | Ketamine 10% injection solution, 10 mL |
Medical oxygen | Linde HKO | 101-HR | compressed gas, 99.5% purity |
nanoScan PET/MR Scanner | Mediso | N/A | 3 Tesla MR |
Needle holder | RWD Life Science Co.,ltd | F31026-12 | Animal surgery tool |
Nucline nanoScan software | Mediso | Version 3.0 | Scanner operating software |
Nylon Suture (6/0 and 5/0) | Healthy Medical Company Ltd | 000524 & 000526 | Animal surgery tool |
Penicillin- Streptomycin | Gibco | 15140122 | Culture media for a final concentration of 50 to 100 I.U./mL penicillin and 50 to 100 µg/mL streptomycin. |
Pentabarbital | AlfaMedic | 13003 | Intraperitoneal injection (330 mg/kg) to induce cessation of breathing of mice |
Sharp scissors | RWD Life Science Co.,ltd | S14014-10 | Animal surgery tool |
Spring Scissors | RWD Life Science Co.,ltd | S11005-09 | Animal surgery tool |
Trypan Blue Solution, 0,4% | Gibco | 15250061 | For cell counting |
Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, 0.25%), phenol red. | Gibco | 25200072 | For cell digestion |
Xylazine | Alfasan International B.V. | HK-56179 | Xylazine 2% injection solution, 30 mL |