Icke-invasiv PET / MR-avbildning i en ortotopisk musmodell av hepatocellulärt karcinom

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att skapa ortotopiskt hepatocellulärt karcinom xenotransplantat med och utan leverartärligering och utföra icke-invasiv positronemissionstomografi (PET) avbildning av tumörhypoxi med [18 F] Fluoromisonidazol ([18 F] FMISO) och [18 F] Fluorodeoxiglukos ([¹⁸F] FDG).

Abstract

Prekliniska experimentella modeller av hepatocellulärt karcinom (HCC) som rekapitulerar mänsklig sjukdom utgör ett viktigt verktyg för att studera tumörgenes och utvärdera nya terapeutiska metoder. Icke-invasiv helkroppsavbildning med positronemissionstomografi (PET) ger kritiska insikter i vävnadernas in vivo-egenskaper på molekylär nivå i realtid. Vi presenterar här ett protokoll för ortotopisk HCC xenograftskapande med och utan leverartärligering (HAL) för att inducera tumörhypoxi och bedömningen av deras tumörmetabolism in vivo med användning av [18 F] Fluoromisonidazol ([18 F] FMISO) och [18 F] Fluorodeoxyglukos ([¹⁸F] FDG) PET / magnetisk resonans (MR) avbildning. Tumörhypoxi kunde lätt visualiseras med hjälp av hypoximarkören [18 F] FMISO, och det visade sig att [18 F] FMISO-upptaget var högre hos HCC-möss som genomgick HAL än i icke-HAL-gruppen, medan [¹⁸F] FDG inte kunde skilja tumörhypoxi mellan de två grupperna. HAL-tumörer visade också en högre nivå av hypoxiinducerbar faktor (HIF)-1α-uttryck som svar på hypoxi. Kvantifiering av HAL-tumörer visade en 2,3-faldig ökning av [¹⁸F] FMISO-upptag baserat på metoden för standardiserat värdeupptag (SUV).

Introduction

Hepatocellulärt karcinom (HCC) är den sjätte mest diagnostiserade cancern och den tredje vanligaste dödsorsaken från cancer över hela världen, med mer än 900 000 nya fall och 800 000 dödsfall 2020¹. Den största riskfaktorn är cirros, som uppstår som ett resultat av virusinfektioner (hepatit B- och C-virus), alkoholmissbruk, diabetes och alkoholfri steatohepatit². Hanteringen av HCC är ganska komplex, och flera behandlingsalternativ finns tillgängliga, inklusive kirurgisk resektion, termisk eller kemisk ablation, transplantation, transarteriell kemoembolisering, strålning och kemoterapi, beroende på sjukdomsstadiet ^2,3. HCC är en kemoterapirefraktär tumör med sjukdomsåterfall hos upp till 70% av patienterna efter behandling med botande avsikt².

Trots den höga graden av tumörheterogenitet är HCC associerad med två vanliga resultat: (i) HCC är mycket hypoxisk och (ii) tumörhypoxi är kopplad till större tumöraggressivitet och behandlingssvikt. Den okontrollerade spridningen av HCC-celler resulterar i en hög syreförbrukningshastighet som föregår vaskularisering, vilket skapar en hypoxisk mikromiljö. Låga intratumorala syrenivåer utlöser sedan en rad biologiska svar som påverkar tumöraggressivitet och behandlingssvar. Hypoxiinducerbara faktorer (HIF) erkänns ofta som de väsentliga transkriptionsregulatorerna vid svar på hypoxi ^2,3. Därför är förmågan att upptäcka hypoxi avgörande för att visualisera neoplastiska vävnader och identifiera de otillgängliga platserna, som kräver invasiva förfaranden. Det bidrar också till att bättre förstå de molekylära förändringar som leder till tumöraggressivitet och förbättra patientens behandlingsresultat.

Molekylär avbildning med positronemissionstomografi (PET) används ofta vid diagnos och stadieindelning av många cancerformer, inklusive HCC. I synnerhet kan kombinerad användning av PET-avbildning med dubbla spårämnen som involverar [18 F]fluorodeoxiglukos ([¹⁸F]FDG) och [¹¹ C]acetat avsevärt öka den totala känsligheten vid HCC-diagnos ^4,5. Avbildning av hypoxi kan å andra sidan uppnås genom att använda den vanliga hypoxiska markören [18 F] Fluoromisonidazol ([¹⁸F] FMISO). I klinisk praxis är den icke-invasiva bedömningen av hypoxi viktig för att skilja mellan olika typer av tumörer och regioner för strålterapiplanering⁶.

Preklinisk avbildning har blivit ett oumbärligt verktyg för icke-invasiv och longitudinell utvärdering av musmodeller för olika sjukdomar. En robust och mycket reproducerbar HCC-modell utgör en viktig plattform för preklinisk och translationell forskning om patofysiologin hos humanläkemedel och bedömningen av nya terapier. Tillsammans med PET-avbildning kan in vivo-beteenden belysas för att ge viktiga insikter på molekylär nivå för en given tidpunkt. Här beskriver vi ett protokoll för generering av leverartärligering (HAL) ortotopisk HCC xenotransplantat och analys av deras in vivo tumörmetabolism med användning av [18 F] FMISO och [¹⁸F] FDG PET / MR. Inkorporeringen av HAL gör en lämplig modell av transgena eller kemiskt inducerade HCC-möss xenotransplantat för att studera tumörhypoxi in vivo, eftersom HAL effektivt kan blockera den arteriella blodtillförseln för att inducera intratumoral hypoxi ^7,8. Dessutom, till skillnad från immunohistokemisk färgning ex vivo med pimonidazol, kan förändringar i tumörmetabolism som ett resultat av hypoxi lätt visualiseras och kvantifieras noggrant icke-invasivt med hjälp av PET-avbildning, vilket möjliggör longitudinell bedömning av behandlingssvar eller mätning av uppkomsten av resistens 3,7,8 . Vår metod som visas här möjliggör skapandet av en robust hypoxisk HCC-modell tillsammans med icke-invasiv övervakning av tumörhypoxi med PET / MR-avbildning för att studera HCC-biologi in vivo.

Protocol

Alla djurstudier utfördes i enlighet med kommittén för användning av levande djur i undervisning och forskning (CULATR) vid Center for Comparative Medicine Research (CCMR) vid University of Hong Kong, ett program ackrediterat av Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC). Djuren som användes i studien var honmöss av typen BALB/cAnN-nu (naken) vid 6-8 veckors ålder, viktade vid 20 g ± 2 g. Mat och vatten tillhandahölls ad libitum. <p class="jove_…

Representative Results

För att erhålla ett lämpligt tumörblock för successiv ortotopisk implantation genererades stabila kloner först genom subkutan injektion av 200 μL cellsuspension i DPBS (innehållande MHCC97L-celler) i den nedre flanken av nakna möss (figur 1A). Tumörtillväxt övervakades och när tumörstorleken nådde 800-1000 mm 3 (cirka 4 veckor efter injektion) avlivades möss och det resulterande tumörblocket skars i cirka 1 mm3 fragment för efterföljande leverortotopi…

Discussion

I denna studie beskrev vi procedurerna för att utföra HAL på leverortotopiska HCC-xenotransplantat med subkutana tumörer, tillsammans med metoder för icke-invasiv övervakning av tumörhypoxi i ortotopiska xenotransplantat med användning av [18 F] FMISO och [¹⁸F] FDG PET / MR. Vårt intresse ligger i metabolisk avbildning av olika cancer- och sjukdomsmodeller för tidig diagnos och utvärdering av behandlingssvar^11,13,14,15<…

Materials

0.9% sterile saline	BBraun	N/A	0.9% sodium chloride intravenous infusion, 500 mL
10# Scalpel blade	RWD Life Science Co.,ltd	S31010-01	Animal surgery tool
10% povidone-iodine solution	Banitore	6.425.678	For disinfection
25G needle with a 1 mL syringe	BD PrecisionGlide	N/A	1 mL syringe with 25G needle for cell suspensions injections
5 mL syringe	Terumo	SS05L	5 mL syringe Luer Lock
70% Ethanol	Merck	1.07017	For disinfection
Automated Cell Counter	Invitrogen	AMQAF2000	For automated cell counting
Buprenorphine	HealthDirect	N/A	Subcutaneous injection (0.05-0.2 mg/kg/12 hours) for analgesic after surgery
Cell Culture Dish (60 mm diameter)	Thermo Scientific	150462	For tumor tissue processing
Centrifuge	Sigma	3-16KL, fixed-angle rotor 12311	For cell suspensions collection
Centrifuge Conical Tube	Eppendorf	EP0030122151	For cell suspensions collection
Culture media (Dulbecco’s modified Eagle’s medium)	Gibco	10566024	high glucose, GlutaMAX™ Supplement
Digital Caliper	RS PRO	841-2518	For subcutaneous tumor size measurement
Direct heat CO2 incubator	Techcomp Limited	NU5841	For cell culture
Dose calibrator	Biodex	N/A	Atomlab 500
DPBS (Dulbecco’s phosphate-buffered saline)	Gibco	14287072	For cell wash and injection
Eye lubricant	Alcon Duratears	N/A	Sterile ocular lubricant ointment, 3.5 g
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	A4766801	Used for a broad range of cell types, especially sensitive cell lines
Forceps (curved fine and straight blunt)	RWD Life Science Co.,ltd	F12012-10 & F12011-13	Animal surgery tool
Heating pad	ALA Scientific Instruments	N/A	Heat pad for mice during surgery
Insulin syringe	Terumo	10ME2913	1 mL insulin syringe with needle for radiotracer injections
InterView fusion software	Mediso	Version 3.03	Post-processing and image analysis software
Inverted microscope	Yu Lung Scientific Co., Ltd	BM-209G	For cells morphology visualization
Isoflurane	Chanelle Pharma	N/A	Iso-Vet, inhalation anesthetic, 250 mL
Ketamine	Alfasan International B.V.	HK-37715	Ketamine 10% injection solution, 10 mL
Medical oxygen	Linde HKO	101-HR	compressed gas, 99.5% purity
nanoScan PET/MR Scanner	Mediso	N/A	3 Tesla MR
Needle holder	RWD Life Science Co.,ltd	F31026-12	Animal surgery tool
Nucline nanoScan software	Mediso	Version 3.0	Scanner operating software
Nylon Suture (6/0 and 5/0)	Healthy Medical Company Ltd	000524 & 000526	Animal surgery tool
Penicillin- Streptomycin	Gibco	15140122	Culture media for a final concentration of 50 to 100 I.U./mL penicillin and 50 to 100 µg/mL streptomycin.
Pentabarbital	AlfaMedic	13003	Intraperitoneal injection (330 mg/kg) to induce cessation of breathing of mice
Sharp scissors	RWD Life Science Co.,ltd	S14014-10	Animal surgery tool
Spring Scissors	RWD Life Science Co.,ltd	S11005-09	Animal surgery tool
Trypan Blue Solution, 0,4%	Gibco	15250061	For cell counting
Trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, 0.25%), phenol red.	Gibco	25200072	For cell digestion
Xylazine	Alfasan International B.V.	HK-56179	Xylazine 2% injection solution, 30 mL