Observasjon av Photobehavior i Chlamydomonas reinhardtii

Summary

De fleste svømmende fotoautotrofiske organismer viser fotoinduserte atferdsendringer (fotobehavior). Den nåværende protokollen observerer nevnte fotobehavior i modellorganismen Chlamydomonas reinhardtii.

Abstract

For motile fototrofiske mikroorganismers overlevelse er det avgjørende å være under riktige lysforhold. Følgelig viser de fotoindusert atferd (eller fotobehavior) og endrer bevegelsesretningen som svar på lys. Typiske fotobehaviors inkluderer photoshock (eller fotofobisk) respons og fototaxis. Photoshock er et svar på en plutselig endring i lysintensiteten (f.eks. blitsbelysning), der organismer midlertidig slutter å bevege seg eller beveger seg bakover. Under fototaxis beveger organismer seg mot lyskilden eller i motsatt retning (henholdsvis kalt positiv eller negativ fototaxis). Den encellede grønne algen Chlamydomonas reinhardtii er en utmerket organisme for å studere fotobehavior fordi den raskt endrer svømmemønsteret ved å modulere juling av cilia (også kalt flagella) etter fotoreception. Her vises ulike enkle metoder for å observere fotobehaviors i C. reinhardtii. Forskning på C. reinhardtiis fotobehaviors har ført til oppdagelsen av vanlige regulatoriske mekanismer mellom eukaryotisk cilia og channelrhodopsins, noe som kan bidra til en bedre forståelse av ciliopatier og utvikling av nye optogenetiske metoder.

Introduction

Lys er en uunnværlig energikilde for fotosyntetiske organismer, men for mye lys kan forårsake fotooksidativ skade. Dermed må fototrofiske organismer overleve under moderat intensitetslys, hvor de kan fotosyntetisere, men ikke lide fotooksidativ skade¹. I landplanter kan kloroplaster ikke bevege seg ut av bladet og vise fotobevegelser i cellen; kloroplaster beveger seg til periferien av cellen under høyt lys og celleoverflaten under lite lys², mens mange motile alger viser fotobehaviors som gjør at de kan finne riktige lysforhold for fotosyntese og dermed lette deres overlevelse³.

Chlamydomonas reinhardtii er en unicellular grønn alge betraktet som en modellorganisme innen forskningsfelt som cilia (også kalt flagella), fotosyntese og fotobehavior. C. reinhardtii presenterer med en øyenskygge og to cilia per celle, som brukes til henholdsvis fotoreception og svømming. Øyepotten har to komponenter: channelrhodopsins (ChRs), lysportede ionkanaler i plasmamembranen og de karotenoidrike granulatlagene som ligger rett bak ChRs. Øyepotten fungerer som en retningslysreseptor siden de karotenoidrike granulatlagene fungerer som en lysreflektor ^4,5.

ChRs ble opprinnelig identifisert som fotoreseptorer som forårsaker fotobehaviors i C. reinhardtii 6,7,8,9. Selv om to isoformer, ChR1 og ChR2, finnes i øyepotet, viste knock-down eksperimenter at ChR1 er den primære fotoreseptoren for fotobehaviors¹⁰. Til tross for dette har ChR2 fått mer oppmerksomhet og spilt en sentral rolle i utviklingen av optogenetikk, en teknikk for å kontrollere celleeksitasjon med lys¹¹. Derfor vil det å studere reguleringsmekanismene som styrer fotobehaviors i C. reinhardtii fremme forståelsen av ChR-funksjonen og forbedre optogenetikken.

Etter fotoreception viser C. reinhardtii celler to typer fotobehaviors: fototaxis og photoshock respons¹². Phototaxis er oppførselen til celler som svømmer i retning av lyskilden eller motsatt retning, henholdsvis kalt positiv eller negativ fototaxis. Photoshock-respons er en oppførsel som celler viser etter å ha merket en plutselig endring i lysintensiteten, for eksempel når de er opplyst av et blits. Celler slutter å svømme eller svømme bakover (dvs. svømme med cellekroppen fremover) i en kort periode, vanligvis <1 s.

Ciliary bevegelser i C. reinhardtii er involvert i sine fotobehaviors. To cilia slår vanligvis som et menneskes brystsvømming, og dette er modulert for fotobehaviors. For fototaxis er kreftene generert av de to cilia ubalansert ved modulering av slagfrekvensen og bølgeformamplituden til hvert cilium¹³. Cilium nærmest øyepotten kalles cis cilium, og den andre kalles trans cilium. Disse to ciliaene er forskjellige på ulike punkter. For eksempel er ciliary slåfrekvensen til trans cilium in vitro 30% -40% høyere¹⁴. I tillegg er deres Ca^{2 +} følsomhet forskjellig. Reaktivering av demembranerte cellemodeller¹⁵ viste at cis cilium slår sterkere enn trans-ciliumet for Ca ²⁺ <1 x ^10-8 M, mens det motsatte gjelder for Ca²⁺ >1 x 10⁻⁷ M. Denne asymmetrien i Ca^{2 +} følsomhet er muligens viktig for fototaktiske svinger siden mutanter som mangler denne asymmetrien ikke viser normal fototaxis^16,17. Omvendt er bølgeformkonvertering nødvendig for photoshock. Den ciliære bølgeformen forvandles fra den asymmetriske bølgeformen i fremoversvømming til den symmetriske bølgeformen i bakoversvømming. Denne bølgeformkonverteringen er også regulert av Ca²⁺, med en terskel på 1 x 10⁻⁴ M^18,19. Siden defekter i regulering av ciliary bevegelser forårsaker primær ciliary dyskinesi hos mennesker, studere fotobehaviors i C. reinhardtii kan bidra til bedre forståelse av disse sykdommene og terapeutisk utvikling²⁰.

Heri demonstreres fire enkle metoder for å observere fotobehaviors i C. reinhardtii . For det første vises en fototaxis-analyse ved hjelp av Petri-retter, og for det andre en fototaxis-analyse mot cellefjæringsdråper. Fenomenet observert i begge tilfeller er ikke strengt fototaxis, men fotoakkumulering, hvor cellene har en tendens til å samle seg nær lyskildesiden eller motsatt side. I C. reinhardtii er fotoakkumulering hovedsakelig forårsaket av fototaxis på en måte som kan brukes som en tilnærming til fototaxis. For det tredje vises en strengere analyse for fototaxis under et mikroskop, og sist er en photoshock-analyse under et mikroskop.

Protocol

I den nåværende studien ble en villtype stamme av Chlamydomonas reinhardtii, et avkom av korset CC-124 x CC-125 med agg1 + mt-, brukt21. CC-124 og CC-125 ble hentet fra Chlamydomonas Resource Center (se Materialfortegnelser) og opprettholdt på et Tris-acetat-fosfat (TAP)22, 1,5% agarose medium ved 20-25 °C. Enhver motil stamme kan brukes til denne protokollen. 1. Cellekultur Kultur en inte…

Representative Results

Typiske C. reinhardtii fototaxis og photoshock responsanalyser vises her. Etter celletetthetsestimering ble villtypecellekultur (et avkom av korset CC-124 × CC-125 med agg1 + mt -)23 vasket med fotobehavior eksperimentell løsning for fototaxis parabolen analysen. Celleopphenget ble plassert under svakt rødt lys i ~ 1 time. En 2 ml celle suspensjon ble plassert i en 3,5 cm Petri tallerken. Petri-parabolen ble ristet forsiktig, satt på en lysboks og fotografert med et kamera festet på …

Discussion

Den nåværende protokollen er enkel og ikke tidkrevende. Hvis en C. reinhardtii mutant mistenkes for å presentere med feil i fotoreception eller ciliary bevegelse, kan denne metoden tjene som primær fenotypisk analyse.

Det finnes imidlertid noen kritiske trinn. Det ene er å bruke celler i eksperimentet i vekstfasen tidlig til midt i loggen. Etter dyrking i lange perioder blir cellene mindre motile, mindre lysfølsomme og danner til og med palmelloider (celleklumper)<sup class="xre…

Materials

15 mL conical tube	SARSTEDT	62.554.502
5 mm Cannonball green LED	Optosupply	OSPG5161P
50 mL conical tube	SARSTEDT	62.547.254
AC adaptor for the light box	ATTO	2196161
Auto cell counter	DeNovix	CellDrop BF
CaCl2	Nakalai tesque	06731-05
Camera flash	NEWWER	TT560
Centrifuge	KUBOTA	2800
Chlamydomonas strains CC-124 and CC-125	Chlamydomonas Resource Center		https://www.chlamycollection.org/
C-mout CCD camera	Wraymer	1129HMN1/3
Desktop darkroom	Scientex	B-S8
Digital still camera	SONY	RX100II
EGTA	Dojindo	G002
Fiji			https://fiji.sc/
Green LED plate	CCS	ISLM-150X150-GG
HCl	Fujifilm WAKO	080-01066
HEPES	Dojindo	GB70
KCl	Nakalai tesque	238514-75
Lightbox (Flat viewer)	ATTO	2196160
Microscope	Olympus	BX-53
Petri dish (φ3.5 cm)	IWAKI	1000-035
Pottasium acetate	Nakalai tesque	28434-25
Power supply for the green LED plate	CCS	ISC-201-2
Red filter	Shibuya Optical	S-RG630