Observation af photobehavior i Chlamydomonas reinhardtii
Summary
De fleste svømmende fotoautotrofe organismer viser fotoinducerede adfærdsændringer (fotoadfærd). Den nuværende protokol observerer den nævnte fotoadfærd i modelorganismen Chlamydomonas reinhardtii.
Abstract
For overlevelsen af de bevægelige fototrofe mikroorganismer er det afgørende at være under ordentlige lysforhold. Derfor viser de fotoinduceret adfærd (eller fotoadfærd) og ændrer deres bevægelsesretning som reaktion på lys. Typiske fotoadfærd inkluderer fotoshock (eller fotofobisk) respons og fototaxis. Photoshock er en reaktion på en pludselig ændring i lysintensitet (f.eks. Flashbelysning), hvor organismer forbigående holder op med at bevæge sig eller bevæger sig baglæns. Under fototaxi bevæger organismer sig mod lyskilden eller i modsat retning (kaldet henholdsvis positiv eller negativ fototaxi). Den encellede grønne alge Chlamydomonas reinhardtii er en fremragende organisme til at studere fotoadfærd, fordi den hurtigt ændrer sit svømmemønster ved at modulere slag af cilia (alias flagella) efter fotoreception. Her vises forskellige enkle metoder til at observere fotoadfærd i C. reinhardtii. Forskning i C. reinhardtiis fotoadfærd har ført til opdagelsen af fælles reguleringsmekanismer mellem eukaryote cilier og channelrhodopsiner, som kan bidrage til en bedre forståelse af ciliopathier og udvikling af nye optogenetiske metoder.
Introduction
Lys er en uundværlig energikilde for fotosyntetiske organismer, men for meget lys kan forårsage foto-oxidativ skade. Således skal fototrofe organismer overleve under moderat intensitetslys, hvor de kan fotosyntetisere, men ikke lide foto-oxidativ skade1. I landplanter kan kloroplaster ikke bevæge sig ud fra bladet og vise fotobevægelser i cellen; kloroplaster bevæger sig til periferien af cellen under højt lys og celleoverfladen under svagt lys2, mens mange bevægelige alger viser fotoadfærd, der giver dem mulighed for at finde ordentlige lysforhold for fotosyntese og dermed lette deres overlevelse3.
Chlamydomonas reinhardtii er en encellet grøn alge, der betragtes som en modelorganisme inden for forskningsområder som cilia (alias flagella), fotosyntese og fotoadfærd. C. reinhardtii præsenterer med en øjenpotte og to cilia pr. celle, der anvendes til henholdsvis fotoreception og svømning. Eyespot har to komponenter: channelrhodopsiner (ChR’er), lys-gated ionkanaler i plasmamembranen og de carotenoidrige granulatlag placeret lige bag ChR’erne. Eyespot fungerer som en retningsbestemt lysreceptor, da de carotenoidrige granulatlag fungerer som en lysreflektor 4,5.
ChR’er blev oprindeligt identificeret som fotoreceptorer, der forårsagede fotoadfærd i C. reinhardtii 6,7,8,9. Selvom to isoformer, ChR1 og ChR2, findes i øjenpotten, viste knock-down eksperimenter, at ChR1 er den primære fotoreceptor for fotoadfærd10. På trods af dette har ChR2 fået mere opmærksomhed og spillet en central rolle i udviklingen af optogenetik, en teknik til at kontrollere celle excitation ved lys11. Derfor vil undersøgelse af reguleringsmekanismerne for fotoadfærd i C. reinhardtii fremme forståelsen af ChR-funktion og forbedre optogenetik.
Efter fotoreception viser C. reinhardtii-celler to typer fotoadfærd: fototaxis og fotoshock respons12. Fototaxis er opførelsen af celler, der svømmer i retning af lyskilden eller den modsatte retning, kaldet henholdsvis positiv eller negativ fototaxis. Fotoshock-respons er en adfærd, som celler viser efter at have registreret en pludselig ændring i lysintensiteten, såsom når den oplyses af en flash. Celler holder op med at svømme eller svømme baglæns (dvs. svømme med cellelegemet fremad) i en kort periode, typisk <1 s.
Ciliære bevægelser i C. reinhardtii er involveret i dens fotoadfærd. To cilia slår normalt som et menneskes brystsvømning, og dette er moduleret til fotoadfærd. For fototaxis er de kræfter, der genereres af de to cilier, ubalanceret ved modulering af slagfrekvensen og bølgeformamplituden for hvert cilium13. Cilium tættest på øjenpotten kaldes cis cilium, og den anden kaldes trans cilium. Disse to cilia adskiller sig på forskellige punkter. For eksempel er ciliary slagfrekvensen af trans cilium in vitro 30% -40% højere14. Derudover er deres Ca2+ følsomhed anderledes. Reaktivering af demembranerede cellemodeller15 viste, at cis-cilium slår stærkere end transcilium for Ca2+ <1 x 10-8 M, mens det modsatte er tilfældet for Ca2+ >1 x 10-7 M. Denne asymmetri i Ca2+ følsomhed er muligvis vigtig for fototaktiske sving, da mutanter, der mangler denne asymmetri, ikke udviser normal fototaxa16,17. Omvendt er bølgeformkonvertering nødvendig for fotoshock. Den ciliære bølgeform forvandler sig fra den asymmetriske bølgeform i fremad svømning til den symmetriske bølgeform i bagudsvømning. Denne bølgeformkonvertering reguleres også af Ca2+, ved en tærskel på 1 x 10-4 M18,19. Da defekter i reguleringen af ciliære bevægelser forårsager primær ciliær dyskinesi hos mennesker, kan undersøgelse af fotoadfærd i C. reinhardtii hjælpe med bedre forståelse af disse sygdomme og terapeutiske udviklinger20.
Heri demonstreres fire enkle metoder til at observere fotoadfærd i C. reinhardtii . For det første vises et fototaxisassay ved hjælp af petriskåle, og for det andet et fototaxisassay mod cellesuspensionsdråber. Fænomenet observeret i begge tilfælde er ikke strengt fototaxis, men fotoakkumulering, hvor cellerne har tendens til at akkumulere tæt på lyskildesiden eller den modsatte side. I C. reinhardtii er fotoakkumulering hovedsageligt forårsaget af fototaxis på en måde, der kan bruges som en tilnærmelse til fototaxis. For det tredje vises et strengere assay for fototaxis under et mikroskop, og sidst er et fotoshock-assay under et mikroskop.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den nuværende protokol er let og ikke tidskrævende. Hvis en C. reinhardtii-mutant mistænkes for at præsentere defekter i fotoreception eller ciliær bevægelse, kan denne metode tjene som primær fænotypisk analyse.
Der findes dog nogle kritiske trin. Den ene er at bruge celler i eksperimentet i den tidlige til midterste vækstfase. Efter dyrkning i lange perioder bliver cellerne mindre bevægelige, mindre lysfølsomme og danner endda palmelloider (celleklumper)…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI (https://www.jsps.go.jp/english/index.html) til NU (19K23758, 21K06295), TH (16H06556) og KW (19H03242, 20K21420, 21H00420), fra Ohsumi Frontier Science Foundation (https://www.ofsf.or.jp/en/) til KW og fra Dynamic Alliance for Open Innovation Bridging Human, Environment and Materials (http://alliance.tagen.tohoku.ac.jp/english/) til NU, TH og KW.
Materials
| 15 mL conical tube | SARSTEDT | 62.554.502 | |
| 5 mm Cannonball green LED | Optosupply | OSPG5161P | |
| 50 mL conical tube | SARSTEDT | 62.547.254 | |
| AC adaptor for the light box | ATTO | 2196161 | |
| Auto cell counter | DeNovix | CellDrop BF | |
| CaCl2 | Nakalai tesque | 06731-05 | |
| Camera flash | NEWWER | TT560 | |
| Centrifuge | KUBOTA | 2800 | |
| Chlamydomonas strains CC-124 and CC-125 | Chlamydomonas Resource Center | https://www.chlamycollection.org/ | |
| C-mout CCD camera | Wraymer | 1129HMN1/3 | |
| Desktop darkroom | Scientex | B-S8 | |
| Digital still camera | SONY | RX100II | |
| EGTA | Dojindo | G002 | |
| Fiji | https://fiji.sc/ | ||
| Green LED plate | CCS | ISLM-150X150-GG | |
| HCl | Fujifilm WAKO | 080-01066 | |
| HEPES | Dojindo | GB70 | |
| KCl | Nakalai tesque | 238514-75 | |
| Lightbox (Flat viewer) | ATTO | 2196160 | |
| Microscope | Olympus | BX-53 | |
| Petri dish (φ3.5 cm) | IWAKI | 1000-035 | |
| Pottasium acetate | Nakalai tesque | 28434-25 | |
| Power supply for the green LED plate | CCS | ISC-201-2 | |
| Red filter | Shibuya Optical | S-RG630 |
References
- Demmig-Adams, B., Adams, W. W. Photoprotection and other responses of plants to high light stress. Annual Reviews Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 43, 599-626 (1992).
- Wada, M. Chloroplast movement. Plant Science. 210, 177-182 (2013).
- Sgarbossa, A., Checcucci, G., Lenci, F. Photoreception and photomovements of microorganisms. Photochemical & Photobiological Sciences. 1 (7), 459-467 (2002).
- Ueki, N., et al. Eyespot-dependent determination of the phototactic sign in Chlamydomonas reinhardtii. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 5299-5304 (2016).
- Foster, K. W., Smyth, R. D. Light antennas in phototactic algae. Microbiological Reviews. 44 (4), 572-630 (1980).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae. Science. 296 (5577), 2395-2398 (2002).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Sineshchekov, O. A., Jung, K. -. H., Spudich, J. L. Two rhodopsins mediate phototaxis to low- and high-intensity light in Chlamydomonas reinhardtii. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (13), 8689-8694 (2002).
- Suzuki, T., et al. Archaeal-type rhodopsins in Chlamydomonas: model structure and intracellular localization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 301 (3), 711-717 (2003).
- Berthold, P., et al. Channelrhodopsin-1 initiates phototaxis and photophobic responses in Chlamydomonas by immediate light-induced depolarization. Plant Cell. 20 (6), 1665-1677 (2008).
- Deisseroth, K., et al. Next-generation optical technologies for illuminating genetically targeted brain circuits. Journal of Neuroscience. 26 (41), 10380-10386 (2006).
- Wakabayashi, K., Isu, A., Ueki, N. Channelrhodopsin-dependent photo-behavioral responses in the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii. Optogenetics (Advances in Experimental Medicine and Biology), 2nd ed. , 21-33 (2021).
- Rüffer, U., Nultsch, W. Flagellar photoresponses of Chlamydomonas cells held on micropipettes: II. Change in flagellar beat pattern. Cell Motility and the Cytoskeleton. 18 (4), 269-278 (1991).
- Kamiya, R., Hasegawa, E. Intrinsic difference in beat frequency between the two flagella of Chlamydomonas reinhardtii. Experimental Cell Research. 173, 299-304 (1987).
- Kamiya, R., Witman, G. B. Submicromolar levels of calcium control the balance of beating between the two flagella in demembranated models of Chlamydomonas. Journal of Cell Biology. 98 (1), 97-107 (1984).
- Okita, N., Isogai, N., Hirono, M., Kamiya, R., Yoshimura, K. Phototactic activity in Chlamydomonas ‘non-phototactic’ mutants deficient in Ca2+-dependent control of flagellar dominance or in inner-arm dynein. Journal of Cell Science. 118, 529-537 (2005).
- Horst, C. J., Witman, G. B. ptx1, a nonphototactic mutant of Chlamydomonas, lacks control of flagellar dominance. Journal of Cell Biology. 120 (3), 733-741 (1993).
- Hyams, J. S., Borisy, G. G. Isolated flagellar apparatus of Chlamydomonas: characterization of forward swimming and alteration of waveform and reversal of motion by calcium ions in vitro. Journal of Cell Science. 33, 235-253 (1978).
- Bessen, M., Fay, R. B., Witman, G. B. Calcium control of waveform in isolated flagellar axonemes of Chlamydomonas. Journal of Cell Biology. 86 (2), 446-455 (1980).
- Reiter, J. F., Leroux, M. R. Genes and molecular pathways underpinning ciliopathies. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (9), 533-547 (2017).
- Ide, T., et al. Identification of the agg1 mutation responsible for negative phototaxis in a "wild-type" strain of Chlamydomonas reinhardtii. Biochemistry and Biophysics Reports. 7, 379-385 (2016).
- Gorman, D. S., Levine, R. P. Cytochrome f and plastocyanin: their sequence in the photosynthetic electron transport chain of Chlamydomonas reinhardi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 54 (6), 1665-1669 (1965).
- Finst, R. J., Kim, P. J., Quarmby, L. M. Genetics of the deflagellation pathway in Chlamydomonas. 유전학. 149 (2), 927-936 (1998).
- Morel-Laurens, N. Calcium control of phototactic orientation in Chlamydomonas reinhardtii: sign and strength of response. Photochemistry and Photobiology. 45 (1), 119-128 (1987).
- Wakabayashi, K., King, S. M. Modulation of Chlamydomonas reinhardtii flagellar motility by redox poise. Journal of Cell Biology. 173 (5), 743-754 (2006).
- Wakabayashi, K., Misawa, Y., Mochiji, S., Kamiya, R. Reduction-oxidation poise regulates the sign of phototaxis in Chlamydomonas reinhardtii. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), 11280-11284 (2011).
- Harris, E. H. . in The Chlamydomonas Sourcebook Second Edition. 1, 25-64 (2009).
- Mergenhagen, D. Circadian clock: genetic characterization of a short period mutant of Chlamydomonas reinhardii. European Journal of Cell Biology. 33 (1), 13-18 (1984).
- Ozasa, K., Lee, J., Song, S., Hara, M., Maeda, M. Two-dimensional optical feedback control of Euglena confined in closed-type microfluidic channels. Lab on a Chip. 11 (11), 1933-1940 (2011).
- Tanno, A., et al. The four-celled Volvocales green alga Tetrabaena socialis exhibits weak photobehavior and high-photoprotection ability. PLoS One. 16 (10), 0259138 (2021).
- Ueno, Y., Aikawa, S., Kondo, A., Akimoto, S. Adaptation of light-harvesting functions of unicellular green algae to different light qualities. Photosynthesis Research. 139 (1-3), 145-154 (2019).
- Takahashi, T., Watanabe, M. Photosynthesis modulates the sign of phototaxis of wild-type Chlamydomonas reinhardtii. Effects of red background illumination and 3-(3′,4′-dichlorophenyl)-1,1-dimethylurea. FEBS Letters. 336 (3), 516-520 (1993).
- Morishita, J., Tokutsu, R., Minagawa, J., Hisabori, T., Wakabayashi, K. I. Characterization of Chlamydomonas reinhardtii mutants that exhibit strong positive phototaxis. Plants (Basel). 10 (7), (2021).
- Fujiu, K., Nakayama, Y., Yanagisawa, A., Sokabe, M., Yoshimura, K. Chlamydomonas CAV2 encodes a voltage- dependent calcium channel required for the flagellar waveform conversion. Current Biology. 19 (2), 133-139 (2009).
- Inaba, K. Calcium sensors of ciliary outer arm dynein: functions and phylogenetic considerations for eukaryotic evolution. Cilia. 4 (1), 6 (2015).
