क्लैमाइडोमोनास रेनहार्डटी में फोटोबिहेवियर का अवलोकन
Summary
अधिकांश तैराकी फोटोऑटोट्रॉफिक जीव फोटो-प्रेरित व्यवहार परिवर्तन (फोटोबिहेवियर) दिखाते हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल मॉडल जीव क्लैमाइडोमोनास रेनहार्डटी में उक्त फोटोबिहेवियर का अवलोकन करता है।
Abstract
मोटाइल फोटोट्रॉफिक सूक्ष्मजीवों के अस्तित्व के लिए, उचित प्रकाश स्थितियों में होना महत्वपूर्ण है। नतीजतन, वे फोटो-प्रेरित व्यवहार (या फोटोबिहेवियर) दिखाते हैं और प्रकाश के जवाब में आंदोलन की अपनी दिशा बदलते हैं। विशिष्ट फोटोबिहेवियर में फोटोशॉक (या फोटोफोबिक) प्रतिक्रिया और फोटोटैक्सिस शामिल हैं। फोटोशॉक प्रकाश तीव्रता (जैसे, फ्लैश रोशनी) में अचानक परिवर्तन की प्रतिक्रिया है, जिसमें जीव क्षणिक रूप से आगे बढ़ना बंद कर देते हैं या पीछे की ओर बढ़ते हैं। फोटोटैक्सिस के दौरान, जीव प्रकाश स्रोत की ओर या विपरीत दिशा में आगे बढ़ते हैं (क्रमशः सकारात्मक या नकारात्मक फोटोटैक्सिस कहा जाता है)। एककोशिकीय हरा शैवाल क्लैमाइडोमोनास रेनहार्डटी फोटोबिहेवियर का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट जीव है क्योंकि यह फोटोरिसेप्शन के बाद सिलिया (उर्फ, फ्लैगेला) की धड़कन को संशोधित करके अपने तैराकी पैटर्न को तेजी से बदलता है। यहां, फोटोबिहेवियर का निरीक्षण करने के लिए विभिन्न सरल तरीकों को दिखाया गया है सी। रेनहार्डटी के फोटोबिहेवियर पर शोध ने यूकेरियोटिक सिलिया और चैनलरोडोप्सिन के बीच सामान्य नियामक तंत्र की खोज की है, जो सिलियोपैथी की बेहतर समझ और नए ऑप्टोजेनेटिक्स विधियों के विकास में योगदान दे सकता है।
Introduction
प्रकाश प्रकाश संश्लेषक जीवों के लिए एक अनिवार्य ऊर्जा स्रोत है, लेकिन बहुत अधिक प्रकाश फोटो-ऑक्सीडेटिव क्षति का कारण बन सकता है। इस प्रकार, फोटोट्रॉफिक जीवों को मध्यम तीव्रता वाले प्रकाश के तहत जीवित रहने की आवश्यकता होती है, जहां वे प्रकाश संश्लेषण कर सकते हैं लेकिन फोटो-ऑक्सीडेटिव क्षति का सामना नहीं कर सकतेहैं 1. भूमि पौधों में, क्लोरोप्लास्ट पत्ती से बाहर नहीं निकल सकते हैं और सेल में फोटो आंदोलनों को दिखा सकते हैं; क्लोरोप्लास्ट उच्च प्रकाश के तहत कोशिका की परिधि में जाते हैं और कम रोशनी2 के तहत कोशिका की सतह, जबकि कई प्रेरक शैवाल फोटोबिहेवियर दिखाते हैं जो उन्हें प्रकाश संश्लेषण के लिए उचित प्रकाश की स्थिति खोजने की अनुमति देते हैं और इस प्रकार, उनके अस्तित्व की सुविधा प्रदान करते हैं3.
क्लैमाइडोमोनास रेनहार्डटी एक एककोशिकीय हरा शैवाल है जिसे सिलिया (उर्फ, फ्लैगेला), प्रकाश संश्लेषण और फोटोबिहेवियर जैसे अनुसंधान क्षेत्रों में एक मॉडल जीव माना जाता है। रेनहार्डटी प्रति सेल एक आईस्पॉट और दो सिलिया के साथ प्रस्तुत करता है, जिसका उपयोग क्रमशः फोटोरिसेप्शन और तैराकी के लिए किया जाता है। आईस्पॉट के दो घटक हैं: चैनलरोडोप्सिन (सीएचआर), प्लाज्मा झिल्ली में हल्के गेटेड आयन चैनल, और सीएचआर के ठीक पीछे स्थित कैरोटीनॉयड समृद्ध ग्रेन्युल परतें। आईस्पॉट एक दिशात्मक प्रकाश रिसेप्टर के रूप में कार्य करता है क्योंकि कैरोटीनॉयड समृद्ध ग्रेन्युल परतें प्रकाश परावर्तक 4,5 के रूप में कार्य करती हैं।
सीएचआर को शुरू में फोटोरिसेप्टर्स के रूप में पहचाना गया था, जो सी रेनहार्डटी 6,7,8,9 में फोटोबिहेवियर पैदा करता था। यद्यपि दो आइसोफॉर्म, सीएचआर 1 और सीएचआर 2, आईस्पॉट में पाए जाते हैं, नॉक-डाउन प्रयोगों से पता चला है कि सीएचआर 1 फोटोबिहेवियर10 के लिए प्राथमिक फोटोरिसेप्टर है। इसके बावजूद, सीएचआर 2 ने अधिक ध्यान आकर्षित किया है और ऑप्टोजेनेटिक्स विकसित करने में एक केंद्रीय भूमिका निभाई है, प्रकाश11 द्वारा सेल उत्तेजना को नियंत्रित करने की तकनीक। इसलिए, सी रेनहार्डटी में फोटोबिहेवियर को नियंत्रित करने वाले नियामक तंत्र का अध्ययन करने से सीएचआर फ़ंक्शन की समझ को आगे बढ़ाया जाएगा और ऑप्टोजेनेटिक्स में सुधार होगा।
रेनहार्डटी कोशिकाएं दो प्रकार के फोटोबिहेवियर दिखाती हैं: फोटोटैक्सिस और फोटोशॉक प्रतिक्रिया12. फोटोटैक्सिस प्रकाश स्रोत या विपरीत दिशा की दिशा में तैरने वाली कोशिकाओं का व्यवहार है, जिसे क्रमशः सकारात्मक या नकारात्मक फोटोटैक्सिस कहा जाता है। फोटोशॉक प्रतिक्रिया एक ऐसा व्यवहार है जो कोशिकाएं प्रकाश की तीव्रता में अचानक परिवर्तन को महसूस करने के बाद दिखाती हैं, जैसे कि फ्लैश द्वारा प्रकाशित होने पर। कोशिकाएं थोड़े समय के लिए तैरना या पीछे तैरना बंद कर देती हैं (यानी, सेल बॉडी के साथ आगे तैरना), आमतौर पर <1 एस।
रेनहार्डटी में सिलिअरी आंदोलन इसके फोटोबिहेवियर में शामिल हैं। दो सिलिया आमतौर पर मानव के ब्रेस्टस्ट्रोक तैराकी की तरह हराते हैं, और यह फोटोबिहेवियर के लिए संशोधित होता है। फोटोटैक्सिस के लिए, दो सिलिया द्वारा उत्पन्न बलों को धड़कन आवृत्ति के मॉडुलन और प्रत्येक सिलियम13 के तरंग आयाम द्वारा असंतुलित किया जाता है। आईस्पॉट के सबसे करीब सिलियम को सीआईएस सिलियम कहा जाता है, और दूसरे को ट्रांस सिलियम कहा जाता है। ये दोनों सिलिया विभिन्न बिंदुओं पर भिन्न होते हैं। उदाहरण के लिए, इन विट्रो में ट्रांस सिलियम की सिलिअरी बीटिंग आवृत्ति 30% -40% अधिक14 है। इसके अलावा, उनकी सीए2 + संवेदनशीलता अलग है। डिमेम्ब्रेनेटेड सेल मॉडल15 के पुनर्सक्रियन से पता चला है कि सीआईएस सिलियम सीए2 + <1 एक्स 10−8 एम के लिए ट्रांस सिलियम की तुलना में अधिक दृढ़ता से धड़कता है, जबकि सीए2 + >1 एक्स 10−7 एम के लिए विपरीत सच है। सीए2+ संवेदनशीलता में यह विषमता संभवतः फोटोटैक्टिक मोड़ के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि इस विषमता की कमी वाले म्यूटेंट सामान्य फोटोटैक्सिस16,17 प्रदर्शित नहीं करते हैं। इसके विपरीत, फोटोशॉक के लिए तरंग रूपांतरण आवश्यक है। सिलिअरी तरंग आगे तैराकी में विषम तरंग से पिछड़ी तैराकी में सममित तरंग में बदल जाती है। इस तरंग रूपांतरण को सीए2+ द्वारा भी विनियमित किया जाता है, 1 एक्स 10−4 एम18,19 की सीमा पर। चूंकि सिलिअरी आंदोलनों को विनियमित करने में दोष मनुष्यों में प्राथमिक सिलिअरी डिस्केनेसिया का कारण बनते हैं, इसलिए सी रेनहार्डटी में फोटोबिहेवियर का अध्ययन करने से इन बीमारियों और चिकित्सीय विकास की बेहतर समझ में मदद मिल सकती है20.
इसमें, सी रेनहार्डटी में फोटोबिहेवियर का निरीक्षण करने के लिए चार सरल तरीकों का प्रदर्शन किया जाता है। सबसे पहले, पेट्री व्यंजनों का उपयोग करके एक फोटोटैक्सिस परख दिखाया गया है, और दूसरा, सेल निलंबन बूंदों के खिलाफ एक फोटोटैक्सिस परख। दोनों मामलों में देखी गई घटना सख्ती से फोटोटैक्सिस नहीं है, लेकिन फोटो संचय है, जहां कोशिकाएं प्रकाश स्रोत पक्ष या विपरीत पक्ष के करीब जमा होती हैं। रेनहार्डटी में, फोटो संचय मुख्य रूप से फोटोटैक्सिस के कारण होता है जिसे फोटोटैक्सिस के सन्निकटन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। तीसरा, एक माइक्रोस्कोप के तहत फोटोटैक्सिस के लिए एक और कठोर परख दिखाया गया है, और अंतिम एक माइक्रोस्कोप के तहत एक फोटोशॉक परख है।
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्तमान प्रोटोकॉल आसान है और समय लेने वाला नहीं है। यदि एक सी रेनहार्डटी उत्परिवर्ती को फोटोरिसेप्शन या सिलिअरी गति में दोषों के साथ पेश करने का संदेह है, तो यह विधि प्राथमिक फेनोटाइपिक विश्लेषण क?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन को जापान सोसाइटी फॉर द प्रमोशन ऑफ साइंस काकेन्ही (https://www.jsps.go.jp/english/index.html) से एनयू (19के 23758, 21के06295), टीएच (16एच06556), और किलोवाट (19एच03242, 20के21420, 21एच00420) से, ओहसुमी फ्रंटियर साइंस फाउंडेशन (https://www.ofsf.or.jp/en/) से किलोवाट तक और डायनामिक एलायंस फॉर ओपन इनोवेशन ब्रिजिंग ह्यूमन, एनवायरनमेंट एंड मटीरियल्स (http://alliance.tagen.tohoku.ac.jp/english/) के अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 15 mL conical tube | SARSTEDT | 62.554.502 | |
| 5 mm Cannonball green LED | Optosupply | OSPG5161P | |
| 50 mL conical tube | SARSTEDT | 62.547.254 | |
| AC adaptor for the light box | ATTO | 2196161 | |
| Auto cell counter | DeNovix | CellDrop BF | |
| CaCl2 | Nakalai tesque | 06731-05 | |
| Camera flash | NEWWER | TT560 | |
| Centrifuge | KUBOTA | 2800 | |
| Chlamydomonas strains CC-124 and CC-125 | Chlamydomonas Resource Center | https://www.chlamycollection.org/ | |
| C-mout CCD camera | Wraymer | 1129HMN1/3 | |
| Desktop darkroom | Scientex | B-S8 | |
| Digital still camera | SONY | RX100II | |
| EGTA | Dojindo | G002 | |
| Fiji | https://fiji.sc/ | ||
| Green LED plate | CCS | ISLM-150X150-GG | |
| HCl | Fujifilm WAKO | 080-01066 | |
| HEPES | Dojindo | GB70 | |
| KCl | Nakalai tesque | 238514-75 | |
| Lightbox (Flat viewer) | ATTO | 2196160 | |
| Microscope | Olympus | BX-53 | |
| Petri dish (φ3.5 cm) | IWAKI | 1000-035 | |
| Pottasium acetate | Nakalai tesque | 28434-25 | |
| Power supply for the green LED plate | CCS | ISC-201-2 | |
| Red filter | Shibuya Optical | S-RG630 |
References
- Demmig-Adams, B., Adams, W. W. Photoprotection and other responses of plants to high light stress. Annual Reviews Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 43, 599-626 (1992).
- Wada, M. Chloroplast movement. Plant Science. 210, 177-182 (2013).
- Sgarbossa, A., Checcucci, G., Lenci, F. Photoreception and photomovements of microorganisms. Photochemical & Photobiological Sciences. 1 (7), 459-467 (2002).
- Ueki, N., et al. Eyespot-dependent determination of the phototactic sign in Chlamydomonas reinhardtii. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 5299-5304 (2016).
- Foster, K. W., Smyth, R. D. Light antennas in phototactic algae. Microbiological Reviews. 44 (4), 572-630 (1980).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae. Science. 296 (5577), 2395-2398 (2002).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Sineshchekov, O. A., Jung, K. -. H., Spudich, J. L. Two rhodopsins mediate phototaxis to low- and high-intensity light in Chlamydomonas reinhardtii. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (13), 8689-8694 (2002).
- Suzuki, T., et al. Archaeal-type rhodopsins in Chlamydomonas: model structure and intracellular localization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 301 (3), 711-717 (2003).
- Berthold, P., et al. Channelrhodopsin-1 initiates phototaxis and photophobic responses in Chlamydomonas by immediate light-induced depolarization. Plant Cell. 20 (6), 1665-1677 (2008).
- Deisseroth, K., et al. Next-generation optical technologies for illuminating genetically targeted brain circuits. Journal of Neuroscience. 26 (41), 10380-10386 (2006).
- Wakabayashi, K., Isu, A., Ueki, N. Channelrhodopsin-dependent photo-behavioral responses in the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii. Optogenetics (Advances in Experimental Medicine and Biology), 2nd ed. , 21-33 (2021).
- Rüffer, U., Nultsch, W. Flagellar photoresponses of Chlamydomonas cells held on micropipettes: II. Change in flagellar beat pattern. Cell Motility and the Cytoskeleton. 18 (4), 269-278 (1991).
- Kamiya, R., Hasegawa, E. Intrinsic difference in beat frequency between the two flagella of Chlamydomonas reinhardtii. Experimental Cell Research. 173, 299-304 (1987).
- Kamiya, R., Witman, G. B. Submicromolar levels of calcium control the balance of beating between the two flagella in demembranated models of Chlamydomonas. Journal of Cell Biology. 98 (1), 97-107 (1984).
- Okita, N., Isogai, N., Hirono, M., Kamiya, R., Yoshimura, K. Phototactic activity in Chlamydomonas ‘non-phototactic’ mutants deficient in Ca2+-dependent control of flagellar dominance or in inner-arm dynein. Journal of Cell Science. 118, 529-537 (2005).
- Horst, C. J., Witman, G. B. ptx1, a nonphototactic mutant of Chlamydomonas, lacks control of flagellar dominance. Journal of Cell Biology. 120 (3), 733-741 (1993).
- Hyams, J. S., Borisy, G. G. Isolated flagellar apparatus of Chlamydomonas: characterization of forward swimming and alteration of waveform and reversal of motion by calcium ions in vitro. Journal of Cell Science. 33, 235-253 (1978).
- Bessen, M., Fay, R. B., Witman, G. B. Calcium control of waveform in isolated flagellar axonemes of Chlamydomonas. Journal of Cell Biology. 86 (2), 446-455 (1980).
- Reiter, J. F., Leroux, M. R. Genes and molecular pathways underpinning ciliopathies. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (9), 533-547 (2017).
- Ide, T., et al. Identification of the agg1 mutation responsible for negative phototaxis in a "wild-type" strain of Chlamydomonas reinhardtii. Biochemistry and Biophysics Reports. 7, 379-385 (2016).
- Gorman, D. S., Levine, R. P. Cytochrome f and plastocyanin: their sequence in the photosynthetic electron transport chain of Chlamydomonas reinhardi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 54 (6), 1665-1669 (1965).
- Finst, R. J., Kim, P. J., Quarmby, L. M. Genetics of the deflagellation pathway in Chlamydomonas. 유전학. 149 (2), 927-936 (1998).
- Morel-Laurens, N. Calcium control of phototactic orientation in Chlamydomonas reinhardtii: sign and strength of response. Photochemistry and Photobiology. 45 (1), 119-128 (1987).
- Wakabayashi, K., King, S. M. Modulation of Chlamydomonas reinhardtii flagellar motility by redox poise. Journal of Cell Biology. 173 (5), 743-754 (2006).
- Wakabayashi, K., Misawa, Y., Mochiji, S., Kamiya, R. Reduction-oxidation poise regulates the sign of phototaxis in Chlamydomonas reinhardtii. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), 11280-11284 (2011).
- Harris, E. H. . in The Chlamydomonas Sourcebook Second Edition. 1, 25-64 (2009).
- Mergenhagen, D. Circadian clock: genetic characterization of a short period mutant of Chlamydomonas reinhardii. European Journal of Cell Biology. 33 (1), 13-18 (1984).
- Ozasa, K., Lee, J., Song, S., Hara, M., Maeda, M. Two-dimensional optical feedback control of Euglena confined in closed-type microfluidic channels. Lab on a Chip. 11 (11), 1933-1940 (2011).
- Tanno, A., et al. The four-celled Volvocales green alga Tetrabaena socialis exhibits weak photobehavior and high-photoprotection ability. PLoS One. 16 (10), 0259138 (2021).
- Ueno, Y., Aikawa, S., Kondo, A., Akimoto, S. Adaptation of light-harvesting functions of unicellular green algae to different light qualities. Photosynthesis Research. 139 (1-3), 145-154 (2019).
- Takahashi, T., Watanabe, M. Photosynthesis modulates the sign of phototaxis of wild-type Chlamydomonas reinhardtii. Effects of red background illumination and 3-(3′,4′-dichlorophenyl)-1,1-dimethylurea. FEBS Letters. 336 (3), 516-520 (1993).
- Morishita, J., Tokutsu, R., Minagawa, J., Hisabori, T., Wakabayashi, K. I. Characterization of Chlamydomonas reinhardtii mutants that exhibit strong positive phototaxis. Plants (Basel). 10 (7), (2021).
- Fujiu, K., Nakayama, Y., Yanagisawa, A., Sokabe, M., Yoshimura, K. Chlamydomonas CAV2 encodes a voltage- dependent calcium channel required for the flagellar waveform conversion. Current Biology. 19 (2), 133-139 (2009).
- Inaba, K. Calcium sensors of ciliary outer arm dynein: functions and phylogenetic considerations for eukaryotic evolution. Cilia. 4 (1), 6 (2015).
