Osservazione del comportamento fotografico in Chlamydomonas reinhardtii
Summary
La maggior parte degli organismi fotoautotrofici che nuotano mostrano cambiamenti comportamentali fotoindotti (comportamento fotografico). Il presente protocollo osserva il suddetto comportamento fotografico nell’organismo modello Chlamydomonas reinhardtii.
Abstract
Per la sopravvivenza dei microrganismi fototrofici mobili, essere in condizioni di luce adeguate è fondamentale. Di conseguenza, mostrano comportamenti fotoindotti (o fotocomportamenti) e alterano la loro direzione di movimento in risposta alla luce. I comportamenti fotografici tipici includono la risposta al fotoshock (o fotofobico) e la fototassi. Il photoshock è una risposta a un improvviso cambiamento dell’intensità della luce (ad esempio, l’illuminazione del flash), in cui gli organismi smettono temporaneamente di muoversi o si muovono all’indietro. Durante la fototaxi, gli organismi si muovono verso la sorgente luminosa o nella direzione opposta (chiamata fototassi positiva o negativa, rispettivamente). L’alga verde unicellulare Chlamydomonas reinhardtii è un organismo eccellente per studiare il comportamento fotografico perché cambia rapidamente il suo modello di nuoto modulando il battito delle ciglia (alias flagelli) dopo la fotoricezione. Qui, vengono mostrati vari metodi semplici per osservare i comportamenti fotografici in C. reinhardtii. La ricerca sui fotocomportamenti di C. reinhardtii ha portato alla scoperta di meccanismi regolatori comuni tra ciglia eucariotiche e channelrhodopsins, che possono contribuire a una migliore comprensione delle ciliopatie e allo sviluppo di nuovi metodi optogenetici.
Introduction
La luce è una fonte di energia indispensabile per gli organismi fotosintetici, ma troppa luce può causare danni fotoossidanti. Pertanto, gli organismi fototrofici devono sopravvivere sotto una luce di intensità moderata, dove possono fotosintetizzare ma non subire danni foto-ossidativi1. Nelle piante terrestri, i cloroplasti non possono uscire dalla foglia e mostrare movimenti fotografici nella cellula; i cloroplasti si spostano alla periferia della cellula in condizioni di luce intensa e la superficie cellulare in condizioni di scarsa illuminazione2, mentre molte alghe mobili mostrano fotocomportamenti che consentono loro di trovare condizioni di luce adeguate per la fotosintesi e, quindi, facilitare la loro sopravvivenza3.
Chlamydomonas reinhardtii è un’alga verde unicellulare considerata un organismo modello in campi di ricerca come le ciglia (alias flagelli), la fotosintesi e il fotocomportamento. C. reinhardtii si presenta con una macchia oculare e due ciglia per cellula, utilizzate rispettivamente per la fotoricezione e il nuoto. La macchia oculare ha due componenti: le channelrhodopsins (ChRs), i canali ionici light-gated nella membrana plasmatica e gli strati di granuli ricchi di carotenoidi situati proprio dietro i ChRs. La macchia oculare agisce come un recettore della luce direzionale poiché gli strati di granuli ricchi di carotenoidi funzionano come un riflettore di luce 4,5.
I ChR sono stati inizialmente identificati come fotorecettori che causano fotocomportamenti in C. reinhardtii 6,7,8,9. Sebbene due isoforme, ChR1 e ChR2, si trovino nella macchia oculare, esperimenti di abbattimento hanno dimostrato che ChR1 è il fotorecettore primario per i fotocomportamenti10. Nonostante ciò, ChR2 ha ricevuto maggiore attenzione e ha svolto un ruolo centrale nello sviluppo dell’optogenetica, una tecnica per controllare l’eccitazione cellulare mediante la luce11. Pertanto, lo studio dei meccanismi regolatori che regolano i fotocomportamentatori in C. reinhardtii favorirà la comprensione della funzione ChR e migliorerà l’optogenetica.
Dopo la fotoricezione, le cellule di C. reinhardtii mostrano due tipi di fotocomportamenti: fototaxi e risposta al fotoshock12. La fototaxi è il comportamento delle cellule che nuotano nella direzione della sorgente luminosa o nella direzione opposta, chiamata fototassi positiva o negativa, rispettivamente. La risposta al fotoshock è un comportamento che le cellule mostrano dopo aver rilevato un improvviso cambiamento nell’intensità della luce, ad esempio quando illuminato da un flash. Le cellule smettono di nuotare o nuotano all’indietro (cioè nuotano con il corpo cellulare in avanti) per un breve periodo, in genere <1 s.
I movimenti ciliari in C. reinhardtii sono coinvolti nei suoi fotocomportamenti. Due ciglia di solito battono come la rana di un essere umano che nuota, e questo è modulato per i fotocomportamenti. Per la fototassi, le forze generate dalle due ciglia sono sbilanciate dalla modulazione della frequenza di battitura e dall’ampiezza della forma d’onda di ciascun cilio13. Il cilio più vicino alla macchia oculare è chiamato cis cilium e l’altro è chiamato trans cilium. Queste due ciglia differiscono su vari punti. Ad esempio, la frequenza di battitura ciliare del transcilio in vitro è del 30%-40% superiorea 14. Inoltre, la loro sensibilità Ca2+ è diversa. La riattivazione dei modelli di cellule demembranate15 ha mostrato che il cis cilium batte più fortemente del trans cilium per Ca2+ <1 x 10−8 M, mentre il contrario è vero per Ca2+ >1 x 10−7 M. Questa asimmetria nella sensibilità di Ca2+ è probabilmente importante per i turni fototattici poiché i mutanti privi di questa asimmetria non presentano una normale fototassi16,17. Al contrario, la conversione della forma d’onda è necessaria per il photoshock. La forma d’onda ciliare si trasforma dalla forma d’onda asimmetrica nel nuoto in avanti alla forma d’onda simmetrica nel nuoto all’indietro. Questa conversione della forma d’onda è regolata anche da Ca2+, ad una soglia di 1 x 10−4 M18,19. Poiché i difetti nella regolazione dei movimenti ciliari causano discinesia ciliare primaria negli esseri umani, lo studio dei fotocomportamentatori in C. reinhardtii potrebbe aiutare a comprendere meglio queste malattie e gli sviluppi terapeutici20.
Qui, vengono dimostrati quattro semplici metodi per osservare i fotocomportamentatori in C. reinhardtii . In primo luogo, viene mostrato un test di fototassi utilizzando piastre di Petri e, in secondo luogo, un test di fototassi contro le goccioline di sospensione cellulare. Il fenomeno osservato in entrambi i casi non è strettamente fototaxi ma fotoaccumulo, dove le cellule tendono ad accumularsi vicino al lato della sorgente luminosa o al lato opposto. In C. reinhardtii, il fotoaccumulo è causato principalmente dalla fototassi in un modo che può essere usato come approssimazione alla fototassi. In terzo luogo, viene mostrato un test più rigoroso per la fototassi al microscopio, e l’ultimo è un test di fotoshock al microscopio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il presente protocollo è facile e non richiede molto tempo. Se si sospetta che un mutante di C. reinhardtii presenti difetti nella fotoricezione o nel moto ciliare, questo metodo potrebbe servire come analisi fenotipica primaria.
Tuttavia, esistono alcuni passaggi critici. Uno è quello di utilizzare le cellule nell’esperimento nella fase di crescita da iniziale a metà registro. Dopo aver coltivato per lunghi periodi, le cellule diventano meno mobili, meno sensibili alla luce e form…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato supportato da sovvenzioni della Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI (https://www.jsps.go.jp/english/index.html) a NU (19K23758, 21K06295), TH (16H06556) e KW (19H03242, 20K21420, 21H00420), dalla Ohsumi Frontier Science Foundation (https://www.ofsf.or.jp/en/) a KW, e dalla Dynamic Alliance for Open Innovation Bridging Human, Environment and Materials (http://alliance.tagen.tohoku.ac.jp/english/) a NU, TH e KW.
Materials
| 15 mL conical tube | SARSTEDT | 62.554.502 | |
| 5 mm Cannonball green LED | Optosupply | OSPG5161P | |
| 50 mL conical tube | SARSTEDT | 62.547.254 | |
| AC adaptor for the light box | ATTO | 2196161 | |
| Auto cell counter | DeNovix | CellDrop BF | |
| CaCl2 | Nakalai tesque | 06731-05 | |
| Camera flash | NEWWER | TT560 | |
| Centrifuge | KUBOTA | 2800 | |
| Chlamydomonas strains CC-124 and CC-125 | Chlamydomonas Resource Center | https://www.chlamycollection.org/ | |
| C-mout CCD camera | Wraymer | 1129HMN1/3 | |
| Desktop darkroom | Scientex | B-S8 | |
| Digital still camera | SONY | RX100II | |
| EGTA | Dojindo | G002 | |
| Fiji | https://fiji.sc/ | ||
| Green LED plate | CCS | ISLM-150X150-GG | |
| HCl | Fujifilm WAKO | 080-01066 | |
| HEPES | Dojindo | GB70 | |
| KCl | Nakalai tesque | 238514-75 | |
| Lightbox (Flat viewer) | ATTO | 2196160 | |
| Microscope | Olympus | BX-53 | |
| Petri dish (φ3.5 cm) | IWAKI | 1000-035 | |
| Pottasium acetate | Nakalai tesque | 28434-25 | |
| Power supply for the green LED plate | CCS | ISC-201-2 | |
| Red filter | Shibuya Optical | S-RG630 |
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