クラミドモナス・ラインハルティイにおける光挙動の観察
Summary
ほとんどの遊泳光独立栄養生物は、光誘発性行動変化(光行動)を示す。本プロトコールは、モデル生物 クラミドモナス・ラインハルティイにおける前記光挙動を観察する。
Abstract
運動性光栄養微生物の生存のためには、適切な光条件下での生存が極めて重要である。その結果、それらは光誘発行動(または光行動)を示し、光に応答して移動方向を変える。典型的な光行動には、光ショック(または光恐怖症)反応および光タクシーが含まれる。光ショックは、光強度の突然の変化(例えば、フラッシュ照明)に対する応答であり、ここで、生物は一過性に動きを止めるか、または後退する。フォトタクシーの間、生物は光源に向かって、または反対の方向に移動します(それぞれ、正または負のフォトタクシーと呼ばれます)。単細胞緑藻 クラミドモナス・ラインハルティイ は、光受容後の繊毛(別名鞭毛)の鼓動を調節することによって水泳パターンを急速に変化させるため、光行動を研究する優れた生物である。ここでは、 C. reinhardtiiにおける光挙動を観察するための様々な簡単な方法が示されている。 C. reinhardtiiの光行動に関する研究は、真核生物繊毛とチャネルロドプシンの間に共通の調節機構の発見につながり、繊毛症の理解を深め、新しい光遺伝学的方法の開発に貢献する可能性がある。
Introduction
光は光合成生物にとって不可欠なエネルギー源ですが、光が多すぎると光酸化的な損傷を引き起こす可能性があります。したがって、光栄養生物は、光合成はできるが光酸化的損傷を受けない適度な強度の光の下で生存する必要がある1。陸上植物では、葉緑体は葉から出て細胞内の写真の動きを示すことはできません。葉緑体は、高光下では細胞の周囲に移動し、低光下では細胞表面2に移動するが、多くの運動性藻類は、光合成のための適切な光条件を見つけることを可能にする光挙動を示し、したがって、それらの生存を促進する3。
クラミドモナス・ラインハルティイは、繊毛(別名、鞭毛)、光合成、光行動などの研究分野でモデル生物と見なされている単細胞緑藻です。C. reinhardtiiは、細胞ごとに1つのアイスポットと2つの繊毛を提示し、それぞれ受光と水泳に使用されます。アイスポットには、チャネルロドプシン(ChR)、原形質膜内の光依存性イオンチャネル、およびChRのすぐ後ろに位置するカロテノイドに富む顆粒層の2つの成分があります。アイスポットは、カロテノイドに富む顆粒層が光反射体として機能するので、指向性光受容体として作用する4,5。
ChRsは当初、C. reinhardtii6,7,8,9において光挙動を引き起こす光受容体として同定された。2つのアイソフォーム、ChR1およびChR2がアイスポットに見出されるが、ノックダウン実験は、ChR1が光挙動10の主要な光受容体であることを示した。それにもかかわらず、ChR2はより注目を集め、光11による細胞励起を制御する技術である光遺伝学の開発において中心的な役割を果たしてきた。したがって、C. reinhardtiiにおける光挙動を支配する調節機構を研究することは、ChR機能の理解を深め、光遺伝学を改善するであろう。
光受容後、 C. reinhardtii 細胞は、フォトタクシーとフォトショック応答の2種類の光挙動を示す12。フォトタクシーは、光源の方向または反対方向に泳ぐ細胞の挙動であり、それぞれ正または負のフォトタクシーと呼ばれます。光ショック応答は、フラッシュによって照らされたときなど、光強度の急激な変化を感知した後に細胞が示す行動である。細胞は、泳ぐのをやめるか、または逆向きに泳ぐ(すなわち、細胞体を前方に泳ぐ)短期間、典型的には<1秒である。
C. reinhardtiiの毛様体の動きは、その写真行動に関与しています。2つの繊毛は通常、人間の平泳ぎのように泳ぐように鼓動し、これは光行動のために変調されます。光タクシーの場合、2つの繊毛によって生成される力は、各繊毛13の拍動周波数および波形振幅の変調によって不均衡になる。アイスポットに最も近い繊毛はシス繊毛と呼ばれ、もう一方はトランス繊毛と呼ばれます。これら2つの繊毛は様々な点で異なります。例えば、インビトロでのトランスシリウムの毛様体拍動頻度は30%〜40%高い14。また、それらのCa2+感度は異なる。デメンブラン化細胞モデル15の再活性化は、シス繊毛がCa2+ <1 x 10−8 Mではトランス繊毛よりも強く鼓動することを示したが、Ca2+ >1 x 10−7 Mではその逆が当てはまる。Ca2+感度におけるこの非対称性は、この非対称性を欠く変異体が正常なフォトタキシスを示さないため、フォトタクティクスターンにとっておそらく重要である16,17。逆に、光衝撃には波形変換が必要です。毛様体波形は、前方スイミングにおける非対称波形から、後方スイミングにおける対称波形に変換される。この波形変換は、Ca2+によっても1 x 10−4 M18,19の閾値で安定化されます。毛様体運動の調節における欠陥はヒトに原発性毛様体ジスキネジアを引き起こすので、C. reinhardtiiにおける光行動を研究することは、これらの疾患および治療開発のよりよい理解に役立つかもしれない20。
本明細書では、 C. reinhardtii における光挙動を観察するための4つの簡単な方法が実証される。第1に、シャーレを用いたフォトタクシーアッセイが示され、第2に、細胞懸濁液液滴に対するフォトタクシーアッセイが示されている。どちらの場合も観察される現象は、厳密にはフォトタクシーではなく、細胞が光源側または反対側の近くに蓄積する傾向がある光蓄積である。 C. reinhardtiiでは、写真の蓄積は主にフォトタクシーによって引き起こされ、フォトタクシーの近似として使用できます。第三に、顕微鏡下でのフォトタクシーのより厳密なアッセイが示され、最後に顕微鏡下でのフォトショックアッセイである。
Protocol
Representative Results
Discussion
現在のプロトコルは簡単で、時間がかかりません。 C. reinhardtii 変異体が光受容または毛様体運動に欠陥を呈している疑いがある場合、この方法は一次表現型解析として役立つ可能性がある。
ただし、いくつかの重要な手順が存在します。1つは、初期から中期に細胞を実験に使用することです。長期間培養すると、細胞は運動性が低下し、光感受性が低下し、パル…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、科学研究費助成事業(基盤研究(https://www.jsps.go.jp/english/index.html)からNU(19K23758、21K06295)、TH(16H06556)、KW(19H03242、20K21420、21H00420)、大隅フロンティアサイエンス財団(https://www.ofsf.or.jp/en/)からKW、および人間・環境・材料をつなぐオープンイノベーションダイナミックアライアンス(http://alliance.tagen.tohoku.ac.jp/english/)からNU、TH、KWへの助成を受けて実施されました。
Materials
| 15 mL conical tube | SARSTEDT | 62.554.502 | |
| 5 mm Cannonball green LED | Optosupply | OSPG5161P | |
| 50 mL conical tube | SARSTEDT | 62.547.254 | |
| AC adaptor for the light box | ATTO | 2196161 | |
| Auto cell counter | DeNovix | CellDrop BF | |
| CaCl2 | Nakalai tesque | 06731-05 | |
| Camera flash | NEWWER | TT560 | |
| Centrifuge | KUBOTA | 2800 | |
| Chlamydomonas strains CC-124 and CC-125 | Chlamydomonas Resource Center | https://www.chlamycollection.org/ | |
| C-mout CCD camera | Wraymer | 1129HMN1/3 | |
| Desktop darkroom | Scientex | B-S8 | |
| Digital still camera | SONY | RX100II | |
| EGTA | Dojindo | G002 | |
| Fiji | https://fiji.sc/ | ||
| Green LED plate | CCS | ISLM-150X150-GG | |
| HCl | Fujifilm WAKO | 080-01066 | |
| HEPES | Dojindo | GB70 | |
| KCl | Nakalai tesque | 238514-75 | |
| Lightbox (Flat viewer) | ATTO | 2196160 | |
| Microscope | Olympus | BX-53 | |
| Petri dish (φ3.5 cm) | IWAKI | 1000-035 | |
| Pottasium acetate | Nakalai tesque | 28434-25 | |
| Power supply for the green LED plate | CCS | ISC-201-2 | |
| Red filter | Shibuya Optical | S-RG630 |
References
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