클라미도모나스 라인하르티이에서의 광행동 관찰
Summary
대부분의 수영 광독립영양 유기체는 광유도 행동 변화 (광행동)를 보여줍니다. 본 프로토콜은 모델 유기체 클라미도모나스 라인하르티이에서 상기 광거동을 관찰한다.
Abstract
운동성 광영양 미생물의 생존을 위해서는 적절한 조명 조건 하에있는 것이 중요합니다. 결과적으로, 그들은 광으로 유발 된 행동 (또는 광행동)을 보여주고 빛에 반응하여 운동 방향을 변경합니다. 일반적인 광동작에는 포토쇼크(또는 포토포빅) 반응과 포토택시가 포함됩니다. 광충격은 광도의 갑작스런 변화 (예를 들어, 플래시 조명)에 대한 반응이며, 여기서 유기체는 일시적으로 움직이지 않거나 뒤로 움직입니다. 광택시 동안, 유기체는 광원을 향해 또는 반대 방향으로 움직입니다 (각각 양성 또는 음수 광택시라고 함). 단세포 녹색 알가 클라미도모나스 라인하르티 이는 광수신 후 섬모(일명 편모)의 박동을 조절하여 수영 패턴을 빠르게 변화시키기 때문에 광행동을 연구하는 데 탁월한 유기체입니다. 여기에서는 C. reinhardtii의 광행동을 관찰하기 위해 다양한 간단한 방법이 나와 있습니다. C. reinhardtii의 광행동에 대한 연구는 진핵 섬모와 채널로돕신 사이의 공통적 인 조절 메커니즘의 발견으로 이어졌으며, 이는 섬모 병증에 대한 더 나은 이해와 새로운 광유전학 방법의 개발에 기여할 수 있습니다.
Introduction
빛은 광합성 유기체에 없어서는 안될 에너지원이지만 너무 많은 빛은 광산화 손상을 일으킬 수 있습니다. 따라서, 광영양 유기체는 광합성을 할 수 있지만 광산화 손상을 겪지 않는 적당한 강도의 빛 아래에서 생존해야합니다1. 육상 식물에서 엽록체는 잎에서 벗어나 세포에서 사진 움직임을 보여줄 수 없습니다. 엽록체는 높은 빛 아래에서 세포의 주변부로 이동하고 낮은 빛 2에서는 세포 표면으로 이동하는 반면, 많은 운동성 조류는 광합성을위한 적절한 조명 조건을 찾아 생존을 촉진 할 수있는 광행동을 보입니다3.
Chlamydomonas reinhardtii는 섬모 (일명 편모), 광합성 및 광행동과 같은 연구 분야에서 모델 유기체로 간주되는 단세포 녹색 알가입니다. C. reinhardtii는 각각 광수신 및 수영에 사용되는 세포 당 하나의 눈반과 두 개의 섬모를 나타냅니다. 아이스팟에는 채널로돕신(ChRs), 원형질막의 라이트 게이티드 이온 채널, ChRs 바로 뒤에 위치한 카로티노이드가 풍부한 과립층의 두 가지 구성 요소가 있습니다. 아이스팟은 카로티노이드가 풍부한 과립층이 광 반사체(4,5)로서 기능하기 때문에 방향성 광 수용체로서 작용한다.
ChRs 는 처음에 C. reinhardtii 6,7,8,9에서 광행동을 일으키는 광수용체로 확인되었다. 두 개의 이소형인 ChR1과 ChR2가 아이스팟에서 발견되지만, 녹다운 실험은 ChR1이 광거동(10)에 대한 1차 광수용체임을 보여주었다. 그럼에도 불구하고, ChR2는 더 많은 주목을 받았으며 광유전학 개발에 중심적인 역할을 했으며, 이는 빛(11)에 의한 세포 자극을 조절하는 기술이다. 따라서 C. reinhardtii의 광행동을 지배하는 규제 메커니즘을 연구하면 ChR 기능에 대한 이해를 높이고 광유전학을 향상시킬 수 있습니다.
광수신 후, C. reinhardtii 세포는 두 가지 유형의 광행동을 보여줍니다 : 광택시와 광충격 반응12. 광택시는 광원의 방향 또는 반대 방향으로 수영하는 세포의 거동으로, 각각 양성 또는 음성 광택시라고 불린다. 광충격 반응은 섬광에 의해 조명될 때와 같이 광도의 급격한 변화를 감지한 후에 세포가 보여주는 행동이다. 세포는 짧은 기간 동안, 전형적으로 <1초 동안 수영을 멈추거나 뒤로 수영(즉, 세포 몸을 앞으로 수영)한다.
C. reinhardtii의 섬모 운동은 그 광행동에 관여합니다. 두 개의 섬모는 보통 인간의 가슴 스트로크 수영처럼 뛰며, 이것은 사진 행동을 위해 변조됩니다. 광택시의 경우, 두 섬모에 의해 생성된 힘은 각 실륨(13)의 박동 주파수 및 파형 진폭의 변조에 의해 불균형해진다. 아이스팟에 가장 가까운 실륨은 시스 실륨이라고 불리고, 다른 하나는 트랜스 실륨이라고합니다. 이 두 섬모는 다양한 점에서 다릅니다. 예를 들어, 시험관 내에서 트랜스 실륨의 섬모 박동 빈도는 30 % -40 % 더 높은14입니다. 또한, 그들의Ca2+ 감도는 다르다. 탈취된 세포 모델(15)의 재활성화는 시스실륨이 Ca2+ <1 x 10-8 M에 대한 트랜스 실륨보다 더 강하게 박동하는 반면, 그 반대는 Ca2+ >1 x 10-7 M에 대해 사실임을 보여주었다. Ca2+ 감도에서의 이러한 비대칭성은 이러한 비대칭성이 결여된 돌연변이체가 정상적인 광택시(16,17)를 나타내지 않기 때문에 광전술 회전에 중요할 수 있다. 반대로, 파형 변환은 광충격을 위해 필요합니다. 섬모 파형은 전방 수영의 비대칭 파형에서 후진 수영의 대칭 파형으로 변환됩니다. 이 파형 변환은 또한 1 x 10-4 M18,19의 임계값에서Ca2+에 의해 조절된다. 섬모 운동 조절의 결함은 인간에게 원발성 섬모 운동 장애를 유발하기 때문에 C. reinhardtii의 광행동을 연구하면 이러한 질병과 치료 개발을 더 잘 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다20.
여기에서, C. reinhardtii 에서 광행동을 관찰하는 네 가지 간단한 방법이 시연된다. 첫째, 페트리 접시를 이용한 광택시 분석법이 도시되고, 둘째, 세포 현탁액 방울에 대한 광택시 분석법이 도시된다. 두 경우 모두 관찰 된 현상은 엄격하게 광탁증이 아니라 세포가 광원 측 또는 반대편에 가깝게 축적되는 경향이있는 사진 축적입니다. C. reinhardtii에서 사진 축적은 주로 포토 택시에 대한 근사치로 사용할 수있는 방식으로 포토 택시에 의해 발생합니다. 셋째, 현미경으로 광택시에 대한보다 엄격한 분석이 표시되고, 마지막으로 현미경으로 광충격 분석이 표시됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
현재 프로토콜은 쉽고 시간이 많이 걸리지 않습니다. C. reinhardtii 돌연변이가 광수신 또는 섬모 운동에 결함을 나타내는 것으로 의심되는 경우,이 방법은 일차 표현형 분석으로 작용할 수 있습니다.
그러나 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 하나는 초기 내지 중간 로그 성장 단계에서 실험에서 세포를 사용하는 것이다. 오랜 기간 동안 배양한 후, 세포는 덜 운동성이되고…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 일본 과학 진흥 협회 KAKENHI (https://www.jsps.go.jp/english/index.html)에서 NU (19K23758, 21K06295), TH (16H06556) 및 KW (19H03242, 20K21420, 21H00420), Ohsumi Frontier Science Foundation (https://www.ofsf.or.jp/en/)에서 KW로, 그리고 인간, 환경 및 재료 (http://alliance.tagen.tohoku.ac.jp/english/)를 NU, TH 및 KW로 연결하는 개방형 혁신을위한 동적 동맹에서 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| 15 mL conical tube | SARSTEDT | 62.554.502 | |
| 5 mm Cannonball green LED | Optosupply | OSPG5161P | |
| 50 mL conical tube | SARSTEDT | 62.547.254 | |
| AC adaptor for the light box | ATTO | 2196161 | |
| Auto cell counter | DeNovix | CellDrop BF | |
| CaCl2 | Nakalai tesque | 06731-05 | |
| Camera flash | NEWWER | TT560 | |
| Centrifuge | KUBOTA | 2800 | |
| Chlamydomonas strains CC-124 and CC-125 | Chlamydomonas Resource Center | https://www.chlamycollection.org/ | |
| C-mout CCD camera | Wraymer | 1129HMN1/3 | |
| Desktop darkroom | Scientex | B-S8 | |
| Digital still camera | SONY | RX100II | |
| EGTA | Dojindo | G002 | |
| Fiji | https://fiji.sc/ | ||
| Green LED plate | CCS | ISLM-150X150-GG | |
| HCl | Fujifilm WAKO | 080-01066 | |
| HEPES | Dojindo | GB70 | |
| KCl | Nakalai tesque | 238514-75 | |
| Lightbox (Flat viewer) | ATTO | 2196160 | |
| Microscope | Olympus | BX-53 | |
| Petri dish (φ3.5 cm) | IWAKI | 1000-035 | |
| Pottasium acetate | Nakalai tesque | 28434-25 | |
| Power supply for the green LED plate | CCS | ISC-201-2 | |
| Red filter | Shibuya Optical | S-RG630 |
References
- Demmig-Adams, B., Adams, W. W. Photoprotection and other responses of plants to high light stress. Annual Reviews Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 43, 599-626 (1992).
- Wada, M. Chloroplast movement. Plant Science. 210, 177-182 (2013).
- Sgarbossa, A., Checcucci, G., Lenci, F. Photoreception and photomovements of microorganisms. Photochemical & Photobiological Sciences. 1 (7), 459-467 (2002).
- Ueki, N., et al. Eyespot-dependent determination of the phototactic sign in Chlamydomonas reinhardtii. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 5299-5304 (2016).
- Foster, K. W., Smyth, R. D. Light antennas in phototactic algae. Microbiological Reviews. 44 (4), 572-630 (1980).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae. Science. 296 (5577), 2395-2398 (2002).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Sineshchekov, O. A., Jung, K. -. H., Spudich, J. L. Two rhodopsins mediate phototaxis to low- and high-intensity light in Chlamydomonas reinhardtii. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (13), 8689-8694 (2002).
- Suzuki, T., et al. Archaeal-type rhodopsins in Chlamydomonas: model structure and intracellular localization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 301 (3), 711-717 (2003).
- Berthold, P., et al. Channelrhodopsin-1 initiates phototaxis and photophobic responses in Chlamydomonas by immediate light-induced depolarization. Plant Cell. 20 (6), 1665-1677 (2008).
- Deisseroth, K., et al. Next-generation optical technologies for illuminating genetically targeted brain circuits. Journal of Neuroscience. 26 (41), 10380-10386 (2006).
- Wakabayashi, K., Isu, A., Ueki, N. Channelrhodopsin-dependent photo-behavioral responses in the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii. Optogenetics (Advances in Experimental Medicine and Biology), 2nd ed. , 21-33 (2021).
- Rüffer, U., Nultsch, W. Flagellar photoresponses of Chlamydomonas cells held on micropipettes: II. Change in flagellar beat pattern. Cell Motility and the Cytoskeleton. 18 (4), 269-278 (1991).
- Kamiya, R., Hasegawa, E. Intrinsic difference in beat frequency between the two flagella of Chlamydomonas reinhardtii. Experimental Cell Research. 173, 299-304 (1987).
- Kamiya, R., Witman, G. B. Submicromolar levels of calcium control the balance of beating between the two flagella in demembranated models of Chlamydomonas. Journal of Cell Biology. 98 (1), 97-107 (1984).
- Okita, N., Isogai, N., Hirono, M., Kamiya, R., Yoshimura, K. Phototactic activity in Chlamydomonas ‘non-phototactic’ mutants deficient in Ca2+-dependent control of flagellar dominance or in inner-arm dynein. Journal of Cell Science. 118, 529-537 (2005).
- Horst, C. J., Witman, G. B. ptx1, a nonphototactic mutant of Chlamydomonas, lacks control of flagellar dominance. Journal of Cell Biology. 120 (3), 733-741 (1993).
- Hyams, J. S., Borisy, G. G. Isolated flagellar apparatus of Chlamydomonas: characterization of forward swimming and alteration of waveform and reversal of motion by calcium ions in vitro. Journal of Cell Science. 33, 235-253 (1978).
- Bessen, M., Fay, R. B., Witman, G. B. Calcium control of waveform in isolated flagellar axonemes of Chlamydomonas. Journal of Cell Biology. 86 (2), 446-455 (1980).
- Reiter, J. F., Leroux, M. R. Genes and molecular pathways underpinning ciliopathies. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (9), 533-547 (2017).
- Ide, T., et al. Identification of the agg1 mutation responsible for negative phototaxis in a "wild-type" strain of Chlamydomonas reinhardtii. Biochemistry and Biophysics Reports. 7, 379-385 (2016).
- Gorman, D. S., Levine, R. P. Cytochrome f and plastocyanin: their sequence in the photosynthetic electron transport chain of Chlamydomonas reinhardi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 54 (6), 1665-1669 (1965).
- Finst, R. J., Kim, P. J., Quarmby, L. M. Genetics of the deflagellation pathway in Chlamydomonas. 유전학. 149 (2), 927-936 (1998).
- Morel-Laurens, N. Calcium control of phototactic orientation in Chlamydomonas reinhardtii: sign and strength of response. Photochemistry and Photobiology. 45 (1), 119-128 (1987).
- Wakabayashi, K., King, S. M. Modulation of Chlamydomonas reinhardtii flagellar motility by redox poise. Journal of Cell Biology. 173 (5), 743-754 (2006).
- Wakabayashi, K., Misawa, Y., Mochiji, S., Kamiya, R. Reduction-oxidation poise regulates the sign of phototaxis in Chlamydomonas reinhardtii. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), 11280-11284 (2011).
- Harris, E. H. . in The Chlamydomonas Sourcebook Second Edition. 1, 25-64 (2009).
- Mergenhagen, D. Circadian clock: genetic characterization of a short period mutant of Chlamydomonas reinhardii. European Journal of Cell Biology. 33 (1), 13-18 (1984).
- Ozasa, K., Lee, J., Song, S., Hara, M., Maeda, M. Two-dimensional optical feedback control of Euglena confined in closed-type microfluidic channels. Lab on a Chip. 11 (11), 1933-1940 (2011).
- Tanno, A., et al. The four-celled Volvocales green alga Tetrabaena socialis exhibits weak photobehavior and high-photoprotection ability. PLoS One. 16 (10), 0259138 (2021).
- Ueno, Y., Aikawa, S., Kondo, A., Akimoto, S. Adaptation of light-harvesting functions of unicellular green algae to different light qualities. Photosynthesis Research. 139 (1-3), 145-154 (2019).
- Takahashi, T., Watanabe, M. Photosynthesis modulates the sign of phototaxis of wild-type Chlamydomonas reinhardtii. Effects of red background illumination and 3-(3′,4′-dichlorophenyl)-1,1-dimethylurea. FEBS Letters. 336 (3), 516-520 (1993).
- Morishita, J., Tokutsu, R., Minagawa, J., Hisabori, T., Wakabayashi, K. I. Characterization of Chlamydomonas reinhardtii mutants that exhibit strong positive phototaxis. Plants (Basel). 10 (7), (2021).
- Fujiu, K., Nakayama, Y., Yanagisawa, A., Sokabe, M., Yoshimura, K. Chlamydomonas CAV2 encodes a voltage- dependent calcium channel required for the flagellar waveform conversion. Current Biology. 19 (2), 133-139 (2009).
- Inaba, K. Calcium sensors of ciliary outer arm dynein: functions and phylogenetic considerations for eukaryotic evolution. Cilia. 4 (1), 6 (2015).
