De fleste svømmende fotoautotrofiske organismer viser fotoinduserte atferdsendringer (fotobehavior). Den nåværende protokollen observerer nevnte fotobehavior i modellorganismen Chlamydomonas reinhardtii.
For motile fototrofiske mikroorganismers overlevelse er det avgjørende å være under riktige lysforhold. Følgelig viser de fotoindusert atferd (eller fotobehavior) og endrer bevegelsesretningen som svar på lys. Typiske fotobehaviors inkluderer photoshock (eller fotofobisk) respons og fototaxis. Photoshock er et svar på en plutselig endring i lysintensiteten (f.eks. blitsbelysning), der organismer midlertidig slutter å bevege seg eller beveger seg bakover. Under fototaxis beveger organismer seg mot lyskilden eller i motsatt retning (henholdsvis kalt positiv eller negativ fototaxis). Den encellede grønne algen Chlamydomonas reinhardtii er en utmerket organisme for å studere fotobehavior fordi den raskt endrer svømmemønsteret ved å modulere juling av cilia (også kalt flagella) etter fotoreception. Her vises ulike enkle metoder for å observere fotobehaviors i C. reinhardtii. Forskning på C. reinhardtiis fotobehaviors har ført til oppdagelsen av vanlige regulatoriske mekanismer mellom eukaryotisk cilia og channelrhodopsins, noe som kan bidra til en bedre forståelse av ciliopatier og utvikling av nye optogenetiske metoder.
Lys er en uunnværlig energikilde for fotosyntetiske organismer, men for mye lys kan forårsake fotooksidativ skade. Dermed må fototrofiske organismer overleve under moderat intensitetslys, hvor de kan fotosyntetisere, men ikke lide fotooksidativ skade1. I landplanter kan kloroplaster ikke bevege seg ut av bladet og vise fotobevegelser i cellen; kloroplaster beveger seg til periferien av cellen under høyt lys og celleoverflaten under lite lys2, mens mange motile alger viser fotobehaviors som gjør at de kan finne riktige lysforhold for fotosyntese og dermed lette deres overlevelse3.
Chlamydomonas reinhardtii er en unicellular grønn alge betraktet som en modellorganisme innen forskningsfelt som cilia (også kalt flagella), fotosyntese og fotobehavior. C. reinhardtii presenterer med en øyenskygge og to cilia per celle, som brukes til henholdsvis fotoreception og svømming. Øyepotten har to komponenter: channelrhodopsins (ChRs), lysportede ionkanaler i plasmamembranen og de karotenoidrike granulatlagene som ligger rett bak ChRs. Øyepotten fungerer som en retningslysreseptor siden de karotenoidrike granulatlagene fungerer som en lysreflektor 4,5.
ChRs ble opprinnelig identifisert som fotoreseptorer som forårsaker fotobehaviors i C. reinhardtii 6,7,8,9. Selv om to isoformer, ChR1 og ChR2, finnes i øyepotet, viste knock-down eksperimenter at ChR1 er den primære fotoreseptoren for fotobehaviors10. Til tross for dette har ChR2 fått mer oppmerksomhet og spilt en sentral rolle i utviklingen av optogenetikk, en teknikk for å kontrollere celleeksitasjon med lys11. Derfor vil det å studere reguleringsmekanismene som styrer fotobehaviors i C. reinhardtii fremme forståelsen av ChR-funksjonen og forbedre optogenetikken.
Etter fotoreception viser C. reinhardtii celler to typer fotobehaviors: fototaxis og photoshock respons12. Phototaxis er oppførselen til celler som svømmer i retning av lyskilden eller motsatt retning, henholdsvis kalt positiv eller negativ fototaxis. Photoshock-respons er en oppførsel som celler viser etter å ha merket en plutselig endring i lysintensiteten, for eksempel når de er opplyst av et blits. Celler slutter å svømme eller svømme bakover (dvs. svømme med cellekroppen fremover) i en kort periode, vanligvis <1 s.
Ciliary bevegelser i C. reinhardtii er involvert i sine fotobehaviors. To cilia slår vanligvis som et menneskes brystsvømming, og dette er modulert for fotobehaviors. For fototaxis er kreftene generert av de to cilia ubalansert ved modulering av slagfrekvensen og bølgeformamplituden til hvert cilium13. Cilium nærmest øyepotten kalles cis cilium, og den andre kalles trans cilium. Disse to ciliaene er forskjellige på ulike punkter. For eksempel er ciliary slåfrekvensen til trans cilium in vitro 30% -40% høyere14. I tillegg er deres Ca2 + følsomhet forskjellig. Reaktivering av demembranerte cellemodeller15 viste at cis cilium slår sterkere enn trans-ciliumet for Ca 2+ <1 x 10-8 M, mens det motsatte gjelder for Ca2+ >1 x 10−7 M. Denne asymmetrien i Ca2 + følsomhet er muligens viktig for fototaktiske svinger siden mutanter som mangler denne asymmetrien ikke viser normal fototaxis16,17. Omvendt er bølgeformkonvertering nødvendig for photoshock. Den ciliære bølgeformen forvandles fra den asymmetriske bølgeformen i fremoversvømming til den symmetriske bølgeformen i bakoversvømming. Denne bølgeformkonverteringen er også regulert av Ca2+, med en terskel på 1 x 10−4 M18,19. Siden defekter i regulering av ciliary bevegelser forårsaker primær ciliary dyskinesi hos mennesker, studere fotobehaviors i C. reinhardtii kan bidra til bedre forståelse av disse sykdommene og terapeutisk utvikling20.
Heri demonstreres fire enkle metoder for å observere fotobehaviors i C. reinhardtii . For det første vises en fototaxis-analyse ved hjelp av Petri-retter, og for det andre en fototaxis-analyse mot cellefjæringsdråper. Fenomenet observert i begge tilfeller er ikke strengt fototaxis, men fotoakkumulering, hvor cellene har en tendens til å samle seg nær lyskildesiden eller motsatt side. I C. reinhardtii er fotoakkumulering hovedsakelig forårsaket av fototaxis på en måte som kan brukes som en tilnærming til fototaxis. For det tredje vises en strengere analyse for fototaxis under et mikroskop, og sist er en photoshock-analyse under et mikroskop.
Den nåværende protokollen er enkel og ikke tidkrevende. Hvis en C. reinhardtii mutant mistenkes for å presentere med feil i fotoreception eller ciliary bevegelse, kan denne metoden tjene som primær fenotypisk analyse.
Det finnes imidlertid noen kritiske trinn. Det ene er å bruke celler i eksperimentet i vekstfasen tidlig til midt i loggen. Etter dyrking i lange perioder blir cellene mindre motile, mindre lysfølsomme og danner til og med palmelloider (celleklumper)<sup class="xre…
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble støttet av tilskudd fra Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI (https://www.jsps.go.jp/english/index.html) til NU (19K23758, 21K06295), TH (16H06556) og KW (19H03242, 20K21420, 21H00420), fra Ohsumi Frontier Science Foundation (https://www.ofsf.or.jp/en/) til KW, og fra Dynamic Alliance for Open Innovation Bridging Human, Environment and Materials (http://alliance.tagen.tohoku.ac.jp/english/) til NU, TH og KW.
15 mL conical tube | SARSTEDT | 62.554.502 | |
5 mm Cannonball green LED | Optosupply | OSPG5161P | |
50 mL conical tube | SARSTEDT | 62.547.254 | |
AC adaptor for the light box | ATTO | 2196161 | |
Auto cell counter | DeNovix | CellDrop BF | |
CaCl2 | Nakalai tesque | 06731-05 | |
Camera flash | NEWWER | TT560 | |
Centrifuge | KUBOTA | 2800 | |
Chlamydomonas strains CC-124 and CC-125 | Chlamydomonas Resource Center | https://www.chlamycollection.org/ | |
C-mout CCD camera | Wraymer | 1129HMN1/3 | |
Desktop darkroom | Scientex | B-S8 | |
Digital still camera | SONY | RX100II | |
EGTA | Dojindo | G002 | |
Fiji | https://fiji.sc/ | ||
Green LED plate | CCS | ISLM-150X150-GG | |
HCl | Fujifilm WAKO | 080-01066 | |
HEPES | Dojindo | GB70 | |
KCl | Nakalai tesque | 238514-75 | |
Lightbox (Flat viewer) | ATTO | 2196160 | |
Microscope | Olympus | BX-53 | |
Petri dish (φ3.5 cm) | IWAKI | 1000-035 | |
Pottasium acetate | Nakalai tesque | 28434-25 | |
Power supply for the green LED plate | CCS | ISC-201-2 | |
Red filter | Shibuya Optical | S-RG630 |