Chlamydomonas reinhardtii'de Fotodavranışın Gözlemlenmesi
Summary
Çoğu yüzme fotoototrofik organizması, foto-kaynaklı davranış değişiklikleri (fotodavranış) gösterir. Mevcut protokol, Chlamydomonas reinhardtii model organizmasında söz konusu fotodavranışı gözlemlemektedir.
Abstract
Hareketli fototrofik mikroorganizmaların hayatta kalması için, uygun ışık koşulları altında olmak çok önemlidir. Sonuç olarak, foto-kaynaklı davranışlar (veya fotodavranış) gösterirler ve ışığa tepki olarak hareket yönlerini değiştirirler. Tipik fotodavranışlar fotoşok (veya fotofobik) tepki ve fototaksileri içerir. Fotoşok, organizmaların geçici olarak hareket etmeyi bıraktığı veya geriye doğru hareket ettiği ışık yoğunluğundaki ani bir değişikliğe (örneğin, flaş aydınlatması) bir cevaptır. Fototaksiler sırasında, organizmalar ışık kaynağına doğru veya ters yönde hareket eder (sırasıyla pozitif veya negatif fototaksi olarak adlandırılır). Tek hücreli yeşil alg Chlamydomonas reinhardtii , foto-davranışı incelemek için mükemmel bir organizmadır, çünkü fotoresepsiyondan sonra kirpiklerin (diğer adıyla flagella) dövülmesini modüle ederek yüzme düzenini hızla değiştirir. Burada, C. reinhardtii’deki fotodavranışları gözlemlemek için çeşitli basit yöntemler gösterilmiştir. C. reinhardtii’nin fotodavranışları üzerine yapılan araştırmalar, ökaryotik kirpikler ve kanalrodopsinler arasında ortak düzenleyici mekanizmaların keşfedilmesine yol açmıştır, bu da siliyopatilerin daha iyi anlaşılmasına ve yeni optogenetik yöntemlerin geliştirilmesine katkıda bulunabilir.
Introduction
Işık, fotosentetik organizmalar için vazgeçilmez bir enerji kaynağıdır, ancak çok fazla ışık foto-oksidatif hasara neden olabilir. Bu nedenle, fototrofik organizmaların, fotosentez yapabilecekleri ancak foto-oksidatif hasara maruz kalmayabilecekleri orta yoğunluklu ışık altında hayatta kalmaları gerekir1. Kara bitkilerinde, kloroplastlar yapraktan dışarı çıkamaz ve hücredeki fotoğraf hareketlerini gösteremez; kloroplastlar, yüksek ışık altında hücrenin çevresine ve düşük ışık altında hücre yüzeyine hareket eder2, oysa birçok hareketli alg, fotosentez için uygun ışık koşullarını bulmalarını sağlayan ve böylece hayatta kalmalarını kolaylaştıran fotodavranışlar gösterir3.
Chlamydomonas reinhardtii, kirpikler (a.k.a., flagella), fotosentez ve fotodavranış gibi araştırma alanlarında model organizma olarak kabul edilen tek hücreli yeşil bir algdir. C. reinhardtii, sırasıyla fotoresepsiyon ve yüzme için kullanılan hücre başına bir göz lekesi ve iki kirpik sunar. Göz lekesinin iki bileşeni vardır: kanalrodopsinler (ChR’ler), plazma zarındaki ışık kapılı iyon kanalları ve ChR’lerin hemen arkasında bulunan karotenoid bakımından zengin granül tabakaları. Göz lekesi, karotenoid bakımından zengin granül tabakaları bir ışık reflektörü olarak işlev gördüğü için yönlü bir ışık reseptörü görevi görür 4,5.
ChR’ler başlangıçta C. reinhardtii 6,7,8,9’da fotobehaviors’a neden olan fotoreseptörler olarak tanımlandı. Göz çukurunda iki izoform, ChR1 ve ChR2 bulunmasına rağmen, yıkma deneyleri, ChR1’in fotodavranışlar10 için birincil fotoreseptör olduğunu göstermiştir. Buna rağmen, ChR2 daha fazla dikkat çekti ve ışık11 ile hücre uyarımını kontrol etmek için bir teknik olan optogenetiğin geliştirilmesinde merkezi bir rol oynadı. Bu nedenle, C. reinhardtii’deki fotodavranışları yöneten düzenleyici mekanizmaların incelenmesi, ChR fonksiyonunun anlaşılmasını daha da ileri götürecek ve optogenetiği geliştirecektir.
Fotoresepsiyondan sonra, C. reinhardtii hücreleri iki tür fotodavranış gösterir: fototaksis ve fotoşok tepkisi12. Fototaksis, sırasıyla pozitif veya negatif fototaksis olarak adlandırılan ışık kaynağı yönünde veya ters yönde yüzen hücrelerin davranışıdır. Fotoşok tepkisi, hücrelerin bir flaşla aydınlatıldığında olduğu gibi ışık yoğunluğundaki ani bir değişikliği algıladıktan sonra gösterdiği bir davranıştır. Hücreler yüzmeyi bırakır veya geriye doğru yüzer (yani, hücre gövdesi ileri doğru yüzer), tipik olarak <1 s.
C. reinhardtii’deki siliyer hareketler fotodavranışlarında rol oynar. İki kirpik genellikle bir insanın kurbağalama yüzmeye çarpması gibi yener ve bu fotodavranışlar için modüle edilir. Fototaksiler için, iki kirpik tarafından üretilen kuvvetler, atma frekansının modülasyonu ve her bir siliyum13’ün dalga formu genliği ile dengesizdir. Göz noktasına en yakın siliuma cis cilium, diğerine trans cilium denir. Bu iki kirpik çeşitli noktalarda farklılık gösterir. Örneğin, in vitro transsiliumun siliyer atma sıklığı% 30 -% 40 daha yüksektir14. Ek olarak, Ca2 + hassasiyetleri farklıdır. Hatırlanan hücre modellerininreaktivasyonu 15, cis siliumunun Ca 2+ <1 x 10−8 M için trans siliumdan daha güçlü bir şekilde attığını, bunun tersinin ise Ca2+ >1 x 10−7 M için geçerli olduğunu göstermiştir. Ca2+ duyarlılığındaki bu asimetri, fototaktik dönüşler için muhtemelen önemlidir, çünkü bu asimetriye sahip olmayan mutantlar normal fototaksis16,17 göstermez. Tersine, fotoşok için dalga formu dönüşümü gereklidir. Siliyer dalga formu, ileri yüzmedeki asimetrik dalga formundan geriye doğru yüzmedeki simetrik dalga formuna dönüşür. Bu dalga formu dönüşümü aynı zamanda Ca2+ tarafından 1 x 10−4 M18,19 eşiğinde düzenlenir. Siliyer hareketlerin düzenlenmesindeki kusurlar insanlarda primer siliyer diskineziye neden olduğundan, C. reinhardtii’deki fotodavranışların incelenmesi bu hastalıkların ve terapötik gelişmelerin daha iyi anlaşılmasına yardımcı olabilir20.
Burada, C. reinhardtii’deki fotodavranışları gözlemlemek için dört basit yöntem gösterilmiştir. İlk olarak, Petri kaplarını kullanan bir fototaksis testi gösterilir ve ikincisi, hücre süspansiyon damlacıklarına karşı bir fototaksis testi gösterilir. Her iki durumda da gözlemlenen fenomen kesinlikle fototaksis değil, hücrelerin ışık kaynağı tarafına veya karşı tarafa yakın birikme eğiliminde olduğu fotoğraf birikimidir. C. reinhardtii’de, fotoğraf birikimi esas olarak fototaksilere bir yaklaşım olarak kullanılabilecek şekilde fototaksislerden kaynaklanır. Üçüncüsü, mikroskop altında fototaksiler için daha titiz bir tahlil gösterilir ve sonuncusu mikroskop altında bir fotoşok testidir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mevcut protokol kolaydır ve zaman alıcı değildir. Bir C. reinhardtii mutantının fotoalımda veya siliyer harekette kusurlarla ortaya çıktığından şüpheleniliyorsa, bu yöntem birincil fenotipik analiz olarak hizmet edebilir.
Ancak, bazı kritik adımlar mevcuttur. Birincisi, deneydeki hücreleri erken ila orta günlük büyüme aşamasında kullanmaktır. Uzun süre kültürlendikten sonra, hücreler daha az hareketli, daha az ışığa duyarlı hale gelir ve hatta palmell…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Japonya Bilimi Geliştirme Derneği KAKENHI’den (https://www.jsps.go.jp/english/index.html) NU’ya (19K23758, 21K06295), TH (16H06556) ve KW (19H03242, 20K21420, 21H00420), Ohsumi Sınır Bilim Vakfı’ndan (https://www.ofsf.or.jp/en/) KW’ye ve İnsan, Çevre ve Malzeme Köprüsü için Dinamik İttifak’tan (http://alliance.tagen.tohoku.ac.jp/english/) NU, TH’ye ve KW’ye hibelerle desteklenmiştir.
Materials
| 15 mL conical tube | SARSTEDT | 62.554.502 | |
| 5 mm Cannonball green LED | Optosupply | OSPG5161P | |
| 50 mL conical tube | SARSTEDT | 62.547.254 | |
| AC adaptor for the light box | ATTO | 2196161 | |
| Auto cell counter | DeNovix | CellDrop BF | |
| CaCl2 | Nakalai tesque | 06731-05 | |
| Camera flash | NEWWER | TT560 | |
| Centrifuge | KUBOTA | 2800 | |
| Chlamydomonas strains CC-124 and CC-125 | Chlamydomonas Resource Center | https://www.chlamycollection.org/ | |
| C-mout CCD camera | Wraymer | 1129HMN1/3 | |
| Desktop darkroom | Scientex | B-S8 | |
| Digital still camera | SONY | RX100II | |
| EGTA | Dojindo | G002 | |
| Fiji | https://fiji.sc/ | ||
| Green LED plate | CCS | ISLM-150X150-GG | |
| HCl | Fujifilm WAKO | 080-01066 | |
| HEPES | Dojindo | GB70 | |
| KCl | Nakalai tesque | 238514-75 | |
| Lightbox (Flat viewer) | ATTO | 2196160 | |
| Microscope | Olympus | BX-53 | |
| Petri dish (φ3.5 cm) | IWAKI | 1000-035 | |
| Pottasium acetate | Nakalai tesque | 28434-25 | |
| Power supply for the green LED plate | CCS | ISC-201-2 | |
| Red filter | Shibuya Optical | S-RG630 |
References
- Demmig-Adams, B., Adams, W. W. Photoprotection and other responses of plants to high light stress. Annual Reviews Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 43, 599-626 (1992).
- Wada, M. Chloroplast movement. Plant Science. 210, 177-182 (2013).
- Sgarbossa, A., Checcucci, G., Lenci, F. Photoreception and photomovements of microorganisms. Photochemical & Photobiological Sciences. 1 (7), 459-467 (2002).
- Ueki, N., et al. Eyespot-dependent determination of the phototactic sign in Chlamydomonas reinhardtii. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 5299-5304 (2016).
- Foster, K. W., Smyth, R. D. Light antennas in phototactic algae. Microbiological Reviews. 44 (4), 572-630 (1980).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae. Science. 296 (5577), 2395-2398 (2002).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Sineshchekov, O. A., Jung, K. -. H., Spudich, J. L. Two rhodopsins mediate phototaxis to low- and high-intensity light in Chlamydomonas reinhardtii. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (13), 8689-8694 (2002).
- Suzuki, T., et al. Archaeal-type rhodopsins in Chlamydomonas: model structure and intracellular localization. Biochemical and Biophysical Research Communications. 301 (3), 711-717 (2003).
- Berthold, P., et al. Channelrhodopsin-1 initiates phototaxis and photophobic responses in Chlamydomonas by immediate light-induced depolarization. Plant Cell. 20 (6), 1665-1677 (2008).
- Deisseroth, K., et al. Next-generation optical technologies for illuminating genetically targeted brain circuits. Journal of Neuroscience. 26 (41), 10380-10386 (2006).
- Wakabayashi, K., Isu, A., Ueki, N. Channelrhodopsin-dependent photo-behavioral responses in the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii. Optogenetics (Advances in Experimental Medicine and Biology), 2nd ed. , 21-33 (2021).
- Rüffer, U., Nultsch, W. Flagellar photoresponses of Chlamydomonas cells held on micropipettes: II. Change in flagellar beat pattern. Cell Motility and the Cytoskeleton. 18 (4), 269-278 (1991).
- Kamiya, R., Hasegawa, E. Intrinsic difference in beat frequency between the two flagella of Chlamydomonas reinhardtii. Experimental Cell Research. 173, 299-304 (1987).
- Kamiya, R., Witman, G. B. Submicromolar levels of calcium control the balance of beating between the two flagella in demembranated models of Chlamydomonas. Journal of Cell Biology. 98 (1), 97-107 (1984).
- Okita, N., Isogai, N., Hirono, M., Kamiya, R., Yoshimura, K. Phototactic activity in Chlamydomonas ‘non-phototactic’ mutants deficient in Ca2+-dependent control of flagellar dominance or in inner-arm dynein. Journal of Cell Science. 118, 529-537 (2005).
- Horst, C. J., Witman, G. B. ptx1, a nonphototactic mutant of Chlamydomonas, lacks control of flagellar dominance. Journal of Cell Biology. 120 (3), 733-741 (1993).
- Hyams, J. S., Borisy, G. G. Isolated flagellar apparatus of Chlamydomonas: characterization of forward swimming and alteration of waveform and reversal of motion by calcium ions in vitro. Journal of Cell Science. 33, 235-253 (1978).
- Bessen, M., Fay, R. B., Witman, G. B. Calcium control of waveform in isolated flagellar axonemes of Chlamydomonas. Journal of Cell Biology. 86 (2), 446-455 (1980).
- Reiter, J. F., Leroux, M. R. Genes and molecular pathways underpinning ciliopathies. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (9), 533-547 (2017).
- Ide, T., et al. Identification of the agg1 mutation responsible for negative phototaxis in a "wild-type" strain of Chlamydomonas reinhardtii. Biochemistry and Biophysics Reports. 7, 379-385 (2016).
- Gorman, D. S., Levine, R. P. Cytochrome f and plastocyanin: their sequence in the photosynthetic electron transport chain of Chlamydomonas reinhardi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 54 (6), 1665-1669 (1965).
- Finst, R. J., Kim, P. J., Quarmby, L. M. Genetics of the deflagellation pathway in Chlamydomonas. 유전학. 149 (2), 927-936 (1998).
- Morel-Laurens, N. Calcium control of phototactic orientation in Chlamydomonas reinhardtii: sign and strength of response. Photochemistry and Photobiology. 45 (1), 119-128 (1987).
- Wakabayashi, K., King, S. M. Modulation of Chlamydomonas reinhardtii flagellar motility by redox poise. Journal of Cell Biology. 173 (5), 743-754 (2006).
- Wakabayashi, K., Misawa, Y., Mochiji, S., Kamiya, R. Reduction-oxidation poise regulates the sign of phototaxis in Chlamydomonas reinhardtii. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), 11280-11284 (2011).
- Harris, E. H. . in The Chlamydomonas Sourcebook Second Edition. 1, 25-64 (2009).
- Mergenhagen, D. Circadian clock: genetic characterization of a short period mutant of Chlamydomonas reinhardii. European Journal of Cell Biology. 33 (1), 13-18 (1984).
- Ozasa, K., Lee, J., Song, S., Hara, M., Maeda, M. Two-dimensional optical feedback control of Euglena confined in closed-type microfluidic channels. Lab on a Chip. 11 (11), 1933-1940 (2011).
- Tanno, A., et al. The four-celled Volvocales green alga Tetrabaena socialis exhibits weak photobehavior and high-photoprotection ability. PLoS One. 16 (10), 0259138 (2021).
- Ueno, Y., Aikawa, S., Kondo, A., Akimoto, S. Adaptation of light-harvesting functions of unicellular green algae to different light qualities. Photosynthesis Research. 139 (1-3), 145-154 (2019).
- Takahashi, T., Watanabe, M. Photosynthesis modulates the sign of phototaxis of wild-type Chlamydomonas reinhardtii. Effects of red background illumination and 3-(3′,4′-dichlorophenyl)-1,1-dimethylurea. FEBS Letters. 336 (3), 516-520 (1993).
- Morishita, J., Tokutsu, R., Minagawa, J., Hisabori, T., Wakabayashi, K. I. Characterization of Chlamydomonas reinhardtii mutants that exhibit strong positive phototaxis. Plants (Basel). 10 (7), (2021).
- Fujiu, K., Nakayama, Y., Yanagisawa, A., Sokabe, M., Yoshimura, K. Chlamydomonas CAV2 encodes a voltage- dependent calcium channel required for the flagellar waveform conversion. Current Biology. 19 (2), 133-139 (2009).
- Inaba, K. Calcium sensors of ciliary outer arm dynein: functions and phylogenetic considerations for eukaryotic evolution. Cilia. 4 (1), 6 (2015).
