Фотодинамический подход к изучению функции разрыва внутриклеточных везикул
Summary
AlPcS-2a-опосредованная хромофорная лазерная инактивация (CALI) является мощным инструментом для изучения пространственно-временного повреждения внутриклеточных везикул (IV) в живых клетках.
Abstract
Внутриклеточные везикулы (IV) образуются в результате эндоцитоза везикул в цитоплазму. Внутривенное образование участвует в активации различных сигнальных путей посредством пермеабилизации внутривенных мембран и образования эндосом и лизосом. Метод, называемый хромофорно-ассистированной лазерной инактивацией (CALI), применяется для изучения образования внутривенных вливаний и материалов, контролирующих внутривенную регуляцию. CALI – это фотодинамическая методология на основе визуализации для изучения сигнального пути, вызванного проникновением мембраны. Метод позволяет пространственно-временные манипуляции с выбранной органеллой проникать в клетку. Метод CALI был применен для наблюдения и мониторинга конкретных молекул путем проникновения эндосом и лизосом. Известно, что разрыв мембраны внутривенных вливаний селективно рекрутирует гликан-связывающие белки, такие как галектин-3. Здесь протокол описывает индукцию внутривенного разрыва AlPcS2a и использование галектина-3 в качестве маркера для маркировки нарушенных лизосом, что полезно при изучении нисходящих эффектов разрыва мембраны IV и их последующих эффектов в различных ситуациях.
Introduction
Эндосомы, тип внутриклеточных везикул (IV), образуются в результате эндоцитоза, а затем созревают в лизосомы. В образовании ВВ участвуют различные внутриклеточные сигнальные пути; кроме того, различные внутренние и внешние стимулы могут повредить внутривенные вливания (например, патогены могут вырваться из ограниченной мембраны во время инфекции и проникнуть в цитоплазму1). Обычно это сопровождается разрывом эндоцитотических везикул2. Таким образом, методы нацеливания и повреждения капельниц могут быть использованы в соответствующих исследованиях3.
Фотодинамическая терапия (ФДТ) – это светозависимая терапия для борьбы с заболеваниями путем уничтожения опухолей или патогенов4. При ФДТ клетки-мишени помечаются нетоксичными хромофорами, называемыми фотосенсибилизаторами, которые могут быть локально активированы световым освещением 5,6. Фотосенсибилизаторы поглощают энергию света и трансформируются в возбужденное синглетное состояние, что приводит к долгоживущему возбужденному триплетному состоянию. Фотосенсибилизаторы триплетного состояния могут подвергаться электронному или энергетическому переносу и образовывать активные формы кислорода (АФК) в присутствии кислорода и могут пространственно разрушать меченые клетки в областиосвещения 7. Последствия варьируются в зависимости от мощности света8. Контролируя концентрацию фотосенсибилизаторов и интенсивность светового освещения, целевые биомолекулы могут быть селективно инактивированы без лизиса клеток, называемого хромофорной инактивацией света (CALI)9. Благодаря значительному развитию фотосенсибилизаторов, которые могут избирательно маркировать различные субклеточные мишени, CALI стал ценным инструментом для контроля светоопосредованной инактивации биомолекул для небольших биомолекул, таких как нуклеотиды и белки, а также органелл, таких как митохондрии и эндолизосомы 3,10,11,12,13.
По сравнению с CALI, химические или физические методы также используются для повреждения мембран, такие как бактериальный токсин 14,15 и лечение лизосомального повреждения Leu-Leu-OMe16. Однако эти методы показывают объемное нарушение внутривенных вливаний в клетках. Надежные фотосенсибилизаторы (т.е. Al(III)фталоцианинхлориддисульфоновая кислота (AlPcS2a)) используются в CALI; AlPcS2a, воздействуя на лизосомы посредством эндоцитоза, используется для разрыва эндосом или лизосом в контролируемой области17. AlPcS2a представляет собой непроницаемый для клеточной мембраны хромофор на основе фталоцианина, который связывается с липидом на плазматической мембране и интернализуется посредством эндоцитоза и в конечном итоге накапливается в лизосоме через эндоцитарный путь18. Он поглощает свет в ближней инфракрасной области спектра и генерирует синглетный кислород, основной АФК, генерируемый возбужденным AlPcS2a18. Распад синглетного кислорода быстро ограничивает его диффузию и расстояние реакции в крошечной области в клетках (примерно 10-20 нм)19. Регулируя продолжительность инкубации AlPcS2a и световое освещение, допускается пространственно-временной контроль повреждения внутривенных вливаний в субклеточной области. Таким образом, CALI становится мощным инструментом для изучения последствий повреждения внутривенного вливания, а также формирования и регулирования внутривенных вливаний.
В этом исследовании рассматривается конкретный протокол CALI с использованием AlPcS2a в качестве фотосенсибилизатора. Этот протокол может применяться к различным типам внутривенных вливаний, включая эндосомы и лизосомы, и использоваться для изучения последующих реакций после разрыва мембраны. Для демонстрации этого протокола используются клетки HeLa, экспрессирующие флуорофор-конъюгированный галектин-316,20, выявленные после разрыва лизосомы.
Protocol
Representative Results
Discussion
AlPcS2a связывается с плазматической мембраной, затем интернализуется эндоцитозом и в конечном итоге накапливается в лизосомах. Таким образом, AlPcS2a может быть локализован в субклеточных компартментах путем регулировки продолжительности инкубации. Ограничением этой методики…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Academia Sinica Inflammation Core Facility, IBMS за поддержку исследований. Основной объект финансируется Проектом Academia Sinica Core Facility and Innovative Instrument (AS-CFII-111-213). Авторы благодарят Common Equipment Core Facility Института биомедицинских наук (IBMS), Academia Sinica (AS) за помощь в получении изображений.
Materials
| Reagent | |||
| Al(III) Phthalocyanine Chloride Disulfonic acid (AlPcS2a) | Frontier Scientific | P40632 | |
| Culture dish | ibidi | 812128-200 | |
| Culture Medium | DMEM supplemented with 10% FBS and 100 U/mL penicillin G and 100 mg/mL Streptomycin | ||
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | A4736301 | |
| Gal3-GFP plasmid | addgene | ||
| Lipofectamine 3000 kit | Thermo Fisher Scientific | L3000008 | |
| LysoTracker Green DND-26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | green fluorescent dye |
| Multiwall plate | perkinelmer | PK-6005550 | |
| NaOH | Thermo Fisher Scientific | Q15895 | |
| OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140163 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 21600-069 | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4 |
| Cell line | |||
| HeLa Cell Line | ATCC | CCL-2 | The methods are applicable for most of the attached cell lines. Conditions must be determined individually. |
| Equipments | |||
| 0.22 µm Filter | Merck | SLGV013SL | |
| Collimated LED Light (660nm) | Thorlabs | M660L3-C1 and DC2100 | Near-infared light is ideal base on the excitation spectrum of AlPcS2a. |
| Confocal microscopy | Carl Zeiss | LSM 780 | An incubation system is required for long-term imaging. |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ||
| Red LED light | Tholabs | M660L4-C1 |
References
- Cossart, P., Helenius, A. Endocytosis of viruses and bacteria. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (8), 016972 (2014).
- Daussy, C. F., Wodrich, H. 34;Repair me if you can": membrane damage, response, and control from the viral perspective. Cells. 9 (9), 2042 (2020).
- Hung, Y. H., Chen, L. M., Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled induction of autophagy-mediated lysosome turnover. Nature Communications. 4, 2111 (2013).
- Sharma, S. K., et al. Photodynamic therapy for cancer and for infections: what is the difference. Israel Journal of Chemistry. 52 (8-9), 691-705 (2012).
- Kübler, A. C. Photodynamic therapy. Medical Laser Application. 20 (1), 37-45 (2005).
- De Rosa, F. S., Bentley, M. V. Photodynamic therapy of skin cancers: sensitizers, clinical studies and future directives. Pharmaceutical Research. 17 (12), 1447-1455 (2000).
- Hamblin, M. R. New photosensitizers for photodynamic therapy. Biochemical Journal. 473 (4), 347-364 (2016).
- Lavie, G., et al. A photodynamic pathway to apoptosis and necrosis induced by dimethyl tetrahydroxyhelianthrone and hypericin in leukaemic cells: possible relevance to photodynamic therapy. British Journal of Cancer. 79 (3-4), 423-432 (1999).
- Jay, D. G. Selective destruction of protein function by chromophore-assisted laser inactivation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 85 (15), 5454-5458 (1988).
- Grate, D., Wilson, C. Laser-mediated, site-specific inactivation of RNA transcripts. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (11), 6131-6136 (1999).
- Lin, J. Y., et al. Optogenetic inhibition of synaptic release with chromophore-assisted light inactivation (CALI). Neuron. 79 (2), 241-253 (2013).
- Hsieh, C. W., Yang, W. Y. Triggering mitophagy with photosensitizers. Methods in Molecular Biology. 1880, 611-619 (2019).
- Yang, J. Y., Yang, W. Y. Spatiotemporally controlled initiation of Parkin-mediated mitophagy within single cells. Autophagy. 7 (10), 1230-1238 (2011).
- Molinari, M., et al. Vacuoles induced by Helicobacter pylori toxin contain both late endosomal and lysosomal markers. Journal of Biological Chemistry. 272 (40), 25339-25344 (1997).
- Prince, L. R., et al. Subversion of a lysosomal pathway regulating neutrophil apoptosis by a major bacterial toxin, pyocyanin. Journal of Immunology. 180 (5), 3502-3511 (2008).
- Aits, S., et al. Sensitive detection of lysosomal membrane permeabilization by lysosomal galectin puncta assay. Autophagy. 11 (8), 1408-1424 (2015).
- Prasmickaite, L., Hogset, A., Berg, K. Evaluation of different photosensitizers for use in photochemical gene transfection. Photochemistry and Photobiology. 73 (4), 388-395 (2001).
- Berg, K., et al. Photochemical internalization: a novel technology for delivery of macromolecules into cytosol. 암 연구학. 59 (6), 1180-1183 (1999).
- Moan, J., Berg, K. The photodegradation of porphyrins in cells can be used to estimate the lifetime of singlet oxygen. Photochemistry and Photobiology. 53 (4), 549-553 (1991).
- Thurston, T. L., Wandel, M. P., von Muhlinen, N., Foeglein, A., Randow, F. Galectin 8 targets damaged vesicles for autophagy to defend cells against bacterial invasion. Nature. 482 (7385), 414-418 (2012).
- Repnik, U., et al. L-leucyl-L-leucine methyl ester does not release cysteine cathepsins to the cytosol but inactivates them in transiently permeabilized lysosomes. Journal of Cell Science. 130 (18), 3124-3140 (2017).
- Griffiths, G., Hoflack, B., Simons, K., Mellman, I., Kornfeld, S. The mannose 6-phosphate receptor and the biogenesis of lysosomes. Cell. 52 (3), 329-341 (1988).
- Jia, J., et al. Galectin-3 Coordinates a cellular system for lysosomal repair and removal. Developmental Cell. 52 (1), 69-87 (2020).
- Chu, Y. P., Hung, Y. H., Chang, H. Y., Yang, W. Y. Assays to monitor lysophagy. Methods in Enzymology. 588, 231-244 (2017).
- Nguyen, L., Madsen, S. J., Berg, K., Hirschberg, H. An improved in vitro photochemical internalization protocol for 3D spheroid cultures. Lasers in Medical Science. 36 (8), 1567-1571 (2021).
- Daugelaviciene, N., et al. Lysosome-targeted photodynamic treatment induces primary keratinocyte differentiation. Journal of Photochemistry and Photobiology. B, Biology. 218, 112183 (2021).
- Hong, M. H., et al. Intracellular galectins control cellular responses commensurate with cell surface carbohydrate composition. Glycobiology. 30 (1), 49-57 (2019).
