細胞内小胞破裂の機能を調べるための光力学的アプローチ

Summary

AlPcS_2aを介した発色団支援レーザー不活性化(CALI)は、生細胞の細胞内小胞(IV)の時空間的損傷を研究するための強力なツールです。

Abstract

細胞内小胞(IV)は、小胞の細胞質へのエンドサイトーシスによって形成されます。IV形成は、IV膜の透過処理やエンドソームやリソソームの形成を通じて、さまざまなシグナル経路の活性化に関与しています。発色団支援レーザー不活性化(CALI)と呼ばれる方法は、IVの形成とIV制御の制御における材料の研究に適用されます。CALIは、膜透過処理によって誘導されるシグナル伝達経路を研究するためのイメージングベースの光力学方法論です。この方法は、選択された細胞小器官の時空間操作を細胞内で透過処理することを可能にする。CALI法は、エンドソームやリソソームの透過処理を通じて特定の分子を観察・モニタリングするために応用されています。IVの膜破裂は、ガレクチン-3などの糖鎖結合タンパク質を選択的に動員することが知られています。ここでは、AlPcS_2a によるIV破裂の誘導と、障害のあるリソソームを標識するためのマーカーとしてのガレクチン-3の使用について説明しており、さまざまな状況下でのIV膜破裂の下流効果とその下流効果の研究に役立ちます。

Introduction

細胞内小胞(IV)の一種であるエンドソームは、エンドサイトーシスによって形成され、その後リソソームに成熟します。さまざまな細胞内シグナル経路がIVの形成に関与しています。さらに、異なる内因性および外因性刺激がIVを損傷する可能性があります(たとえば、病原体は感染中に境界膜から逃げ出し、細胞質¹に入る可能性があります)。これは通常、エンドサイトーシス小胞²の破裂を伴う。したがって、IVを標的にして損傷を与えるための技術は、^{関連する研究3}で使用できます。

光線力学療法(PDT)は、腫瘍や病原体を殺すことによって病気と戦うための光依存療法です⁴。PDTでは、標的細胞は、光増感剤と呼ばれる非毒性発色団で標識され、光照射によって局所的に活性化され得る^5,6。光増感剤は光からエネルギーを吸収して励起一重項状態に変化し、長寿命の励起三重項状態になります。三重項状態の光増感剤は、電子またはエネルギー移動を受け、酸素の存在下で活性酸素種(ROS)を形成することができ、照明領域⁷内の標識細胞を空間的に破壊することができる。結果は光の力によって異なります⁸.光増感剤の濃度と光照射の強度を制御することにより、発色団支援光不活性化(CALI)⁹と呼ばれる、細胞溶解なしで標的生体分子を選択的に不活性化することができます。さまざまな細胞内標的を選択的に標識できる光増感剤の大幅な開発により、CALIは、ヌクレオチドやタンパク質などの低分子生体分子、およびミトコンドリアやエンドリソソームなどの細胞小器官の生体分子の光を介した不活性化を制御するための貴重なツールになりました3,10,11,12,13。

CALIと比較して、細菌毒素^14,15やリソソーム損傷に対するLeu-Leu-OMe¹⁶治療などの膜を損なうために化学的または物理的方法も使用されます。ただし、これらの方法では、細胞内のIVの大量の障害が表示されます。堅牢な光増感剤(すなわち、Al(III)フタロシアニンクロリドジスルホン酸(AlPcS_2a))がCALIで使用されます。_AlPcS2aは、エンドサイトーシスを介してリソソームを標的とし、制御領域¹⁷においてエンドソームまたはリソソームを破裂させるために使用される。_AlPcS2aは、細胞膜不透過性のフタロシアニンベースの発色団であり、原形質膜上の脂質に結合し、エンドサイトーシスを介してインターナライズされ、最終的にはエンドサイトーシス経路¹⁸を介してリソソーム内に蓄積する。近赤外スペクトル領域内の光を吸収し、励起されたAlPcS_2a¹⁸によって生成される主要なROSである一重項酸素を生成します。一重項酸素の崩壊は、細胞内の小さな領域(約10-20 nm)内での拡散と反応の距離を急速に制限します¹⁹。AlPcS_2aインキュベーションと光照明の持続時間を調整することにより、細胞内領域内のIVの損傷の時空間制御が可能になります。したがって、CALIは、IV損傷の結果、およびIVの形成と調節を調べるための強力なツールになります。

この研究では、光増感剤としてAlPcS_2aを使用するCALIの特定のプロトコルに対処します。このプロトコルは、エンドソームやリソソームを含むさまざまなタイプのIVに適用でき、膜破裂後のフォローアップ応答を調べるために使用できます。リソソーム破裂後に明らかにされた蛍光色素結合ガレクチン-3^16,20を発現するHeLa細胞を使用して、このプロトコルを実証します。

Protocol

1. AlPcS2a ストック調製 10 mgのAlPcS2a を400 μLの0.1 M NaOHに溶解します。溶解性を向上させるには、溶液を50°Cで加熱し、渦巻きます。 溶液を4 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)と混合します。次に、溶液を0.22 μmフィルターでろ過し、不溶性沈殿物を除去します。 UV-Vis分光光度計で溶液の濃度を測定します。672 nmにおけるAlPcS2aの吸光係数は4…

Representative Results

エンドソームおよびリソソームを含むIVのAlPcS2a誘発損傷を表す模式図が示されている(図1)。 市販のマーカーを使用して、AlPcS2a 染色条件を決定することができる。例えば、AlPcS2a 点状点および緑色蛍光色素22 共局在(図2)。 蛍光色素標識ガレクチン-3は、IV損傷をモ?…

Discussion

AlPcS_2aは原形質膜に結合し、次いでエンドサイトーシスによって内在化され、最終的にリソソームに蓄積する。_AlPcS2aは、したがって、インキュベーション期間を調整することによって細胞内区画に局在化することができる。この方法論の限界は、ERやゴルジ装置など、IVの膜源が他にもたくさんあるため、エンドサイトーシスを介してAlPcS_2aによって標識できるのはIVの?…

Materials

Reagent
Al(III) Phthalocyanine Chloride Disulfonic acid (AlPcS2a)	Frontier Scientific	P40632
Culture dish	ibidi	812128-200
Culture Medium			DMEM supplemented with 10% FBS and 100 U/mL penicillin G and 100 mg/mL Streptomycin
DMEM	Gibco	11965092
FBS	Thermo Fisher Scientific	A4736301
Gal3-GFP plasmid	addgene
Lipofectamine 3000 kit	Thermo Fisher Scientific	L3000008
LysoTracker Green DND-26	Thermo Fisher Scientific	L7526	green fluorescent dye
Multiwall plate	perkinelmer	PK-6005550
NaOH	Thermo Fisher Scientific	Q15895
OptiMEM	Thermo Fisher Scientific	31985070
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140163
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Gibco	21600-069	137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4
Cell line
HeLa Cell Line	ATCC	CCL-2	The methods are applicable for most of the attached cell lines. Conditions must be determined individually.
Equipments
0.22 µm Filter	Merck	SLGV013SL
Collimated LED Light  (660nm)	Thorlabs	M660L3-C1 and DC2100	Near-infared light is ideal base on the excitation spectrum of AlPcS2a.
Confocal microscopy	Carl Zeiss	LSM 780	An incubation system is required for long-term imaging.
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers	Thermo Fisher Scientific
Red LED light	Tholabs	M660L4-C1