AlPcS2a-medierad kromoforassisterad laserinaktivering (CALI) är ett kraftfullt verktyg för att studera spatiotemporal skada av intracellulära vesiklar (IV) i levande celler.
Intracellulära vesiklar (IV) bildas genom endocytos av vesiklar i cytoplasma. IV-bildning är involverad i aktivering av olika signalvägar genom permeabilisering av IV-membran och bildandet av endosomer och lysosomer. En metod som kallas kromoforassisterad laserinaktivering (CALI) används för att studera bildandet av intravenösa läkemedel och materialen vid styrning av intravenös reglering. CALI är en bildbaserad fotodynamisk metod för att studera signalvägen inducerad av membranpermeabilisering. Metoden tillåter spatiotemporal manipulation av den valda organellen att permeabiliseras i en cell. CALI-metoden har tillämpats för att observera och övervaka specifika molekyler genom permeabilisering av endosomer och lysosomer. Membranbrottet av IV är känt för att selektivt rekrytera glykanbindande proteiner, såsom galectin-3. Här beskriver protokollet induktionen av IV-ruptur av AlPcS2a och användningen av galectin-3 som en markör för att märka nedsatta lysosomer, vilket är användbart för att studera nedströmseffekterna av IV-membranbrott och deras nedströmseffekter under olika situationer.
Endosomer, en typ av intracellulär vesikel (IV), bildas av endocytos och mognar sedan till lysosomer. Olika intracellulära signalvägar är involverade i bildandet av IV; Dessutom kan olika inneboende och yttre stimuli skada IV (t.ex. patogener kan fly från det avgränsade membranet under infektion och gå in i cytoplasma1). Detta åtföljs vanligtvis av bristning av endocytotiska vesiklar2. Därför kan teknikerna för inriktning och skada IV användas i relaterade studier3.
Fotodynamisk terapi (PDT) är en ljusberoende terapi för att bekämpa sjukdomar genom att döda tumörer eller patogener4. I PDT är riktade celler märkta med giftfria kromoforer, kallade fotosensibiliserare, som kan aktiveras lokalt med ljusbelysning 5,6. Fotosensibilisatorer absorberar energi från ljus och omvandlas till ett exciterat singletttillstånd, vilket leder till det långlivade exciterade tripletttillståndet. Fotosensibilisatorer i tripletttillståndet kan genomgå elektron- eller energiöverföring och bilda reaktiva syrearter (ROS) i närvaro av syre och kan rumsligt förstöra märkta celler inom belysningsområdet7. Konsekvensen varierar beroende på ljusets kraft8. Genom att kontrollera koncentrationen av fotosensibilisatorer och intensiteten hos ljusbelysning kan riktade biomolekyler selektivt inaktiveras utan celllys, benämnd kromoforassisterad ljusinaktivering (CALI)9. Med den betydande utvecklingen av fotosensibilisatorer som selektivt kan märka olika subcellulära mål har CALI blivit ett värdefullt verktyg för att kontrollera ljusmedierad inaktivering av biomolekyler för små biomolekyler såsom nukleotider och proteiner, liksom organeller såsom mitokondrier och endososomer 3,10,11,12,13.
Jämfört med Cali används kemiska eller fysiska metoder också för att försämra membran, såsom bakterietoxin 14,15 och Leu-Leu-OMe 16-behandling för lysosomal skada. Dessa metoder visar emellertid bulkförsämring av IV i celler. Robusta fotosensibilisatorer (dvs. Al(III)ftalocyaninkloriddisulfonsyra (AlPcS2a)) används i CALI; AlPcS 2a, som riktar sig mot lysosomerna genom endocytos, används för attbrista endosomer eller lysosomer i en kontrollerad region17. AlPcS2a är en cellmembranogenomtränglig ftalocyaninbaserad kromofor som binder till lipid på plasmamembran och internaliseras genom endocytos och ackumuleras så småningom i lysosomen genom den endocytiska vägen18. Det absorberar ljus inom ett nära infrarött spektralområde och genererar singlettsyre, en viktig ROS som genereras av exciterad AlPcS2a18. Singlettsyresönderfall begränsar snabbt dess diffusions- och reaktionsavstånd inom ett litet område i celler (ungefär 10-20 nm)19. Genom att justeravaraktigheten av AlPcS 2a-inkubation och ljusbelysning tillåts spatiotemporal kontroll av skadorna på IV inom ett subcellulärt område. CALI blir därför ett kraftfullt verktyg för att undersöka konsekvenserna av IV-skador och bildandet och regleringen av IV.
I denna studie behandlas ett specifikt protokoll för CALI som använder AlPcS2a som fotosensibiliserare. Detta protokoll kan tillämpas på olika typer av IV, inklusive endosomer och lysosomer, och används för att undersöka uppföljningssvaren efter membranbrott. HeLa-celler som uttrycker fluoroforkonjugerat galectin-316,20 som avslöjats efter lysosombrott används för att demonstrera detta protokoll.
AlPcS2a binder till plasmamembranet, internaliseras sedan av endocytos och ackumuleras så småningom i lysosomer. AlPcS2a kan således lokaliseras i de subcellulära facken genom att justera inkubationstiden. En begränsning av denna metod är att endast en subpopulation av IV kan märkas av AlPcS2a genom endocytos eftersom det finns många andra membrankällor för IV, såsom ER och Golgi-apparater. Dessutom skulle den selektiva märkningen av AlPcS 2a i tidiga ellersena endo…
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Academia Sinica Inflammation Core Facility, IBMS för forskningsstöd. Kärnfaciliteten finansieras av Academia Sinica Core Facility and Innovative Instrument Project (AS-CFII-111-213). Författarna tackar Common Equipment Core Facility vid Institute of Biomedical Sciences (IBMS), Academia Sinica (AS) för att hjälpa bildförvärvet.
Reagent | |||
Al(III) Phthalocyanine Chloride Disulfonic acid (AlPcS2a) | Frontier Scientific | P40632 | |
Culture dish | ibidi | 812128-200 | |
Culture Medium | DMEM supplemented with 10% FBS and 100 U/mL penicillin G and 100 mg/mL Streptomycin | ||
DMEM | Gibco | 11965092 | |
FBS | Thermo Fisher Scientific | A4736301 | |
Gal3-GFP plasmid | addgene | ||
Lipofectamine 3000 kit | Thermo Fisher Scientific | L3000008 | |
LysoTracker Green DND-26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | green fluorescent dye |
Multiwall plate | perkinelmer | PK-6005550 | |
NaOH | Thermo Fisher Scientific | Q15895 | |
OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140163 | |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 21600-069 | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4 |
Cell line | |||
HeLa Cell Line | ATCC | CCL-2 | The methods are applicable for most of the attached cell lines. Conditions must be determined individually. |
Equipments | |||
0.22 µm Filter | Merck | SLGV013SL | |
Collimated LED Light (660nm) | Thorlabs | M660L3-C1 and DC2100 | Near-infared light is ideal base on the excitation spectrum of AlPcS2a. |
Confocal microscopy | Carl Zeiss | LSM 780 | An incubation system is required for long-term imaging. |
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ||
Red LED light | Tholabs | M660L4-C1 |