研究细胞内囊泡破裂功能的光动力方法

Summary

AlPcS_2a介导的发色团辅助激光灭活（CALI）是研究活细胞中细胞内囊泡（IVs）时空损伤的强大工具。

Abstract

细胞内囊泡（IV）是通过囊泡内吞作用形成细胞质而形成的。IV形成通过IV膜的透化以及内体和溶酶体的形成参与激活各种信号通路。一种称为发色团辅助激光灭活（CALI）的方法用于研究IV的形成和控制IV调节的材料。CALI是一种基于成像的光动力方法，用于研究膜透化诱导的信号通路。该方法允许对所选细胞器进行时空操作以在细胞中透化。CALI方法已被应用于通过内体和溶酶体的透化来观察和监测特定分子。已知IV的膜破裂会选择性地募集聚糖结合蛋白，例如半乳糖凝集素-3。在这里，该协议描述了AlPcS_2a 诱导IV破裂和使用半乳糖凝集素-3作为标记受损溶酶体的标记物，这对于研究IV膜破裂的下游效应及其在各种情况下的下游效应是有用的。

Introduction

内体是一种细胞内囊泡（IV），通过内吞作用形成，然后成熟为溶酶体。各种细胞内信号通路参与IV的形成;此外，不同的内在和外在刺激会损害静脉注射（例如，病原体在感染期间可以从边界膜逸出并进入细胞质¹）。这通常伴有内吞囊泡破裂²。因此，靶向和破坏IV的技术可用于相关研究³。

光动力疗法（PDT）是一种光依赖性疗法，通过杀死肿瘤或病原体来对抗疾病^4。在PDT中，靶细胞用无毒发色团标记，称为光敏剂，可以通过光照明^局部激活5^，6。光敏剂从光中吸收能量并转化为激发的单重态，导致长寿命的激发三重态。三重态的光敏剂可以在氧气存在下发生电子或能量转移并形成活性氧（ROS），并且可以在空间上破坏照明区域内的标记细胞⁷。结果因光的力量而异⁸.通过控制光敏剂的浓度和光照明强度，可以在不进行细胞裂解的情况下选择性地灭活目标生物分子，称为发色团辅助光灭活（CALI）⁹。随着可以选择性标记各种亚细胞靶标的光敏剂的重大发展，CALI 已成为控制光介导的生物分子灭活的有价值的工具，用于小生物分子（如核苷酸和蛋白质）以及细胞器（如线粒体和内溶酶体³，^10，11，^12，13）。

与CALI相比，化学或物理方法也用于损害膜，例如细菌毒素^14，15 和Leu-Leu-OMe¹⁶ 治疗溶酶体损伤。然而，这些方法显示细胞内IV的大量损伤。在CALI中使用强大的光敏剂（即氯化酞菁二磺酸Al（III）（AlPcS_2a））;AlPcS_2a通过内吞作用靶向溶酶体，用于在受控区域¹⁷中破裂内体或溶酶体。AlPcS_2a 是一种细胞膜不可渗透的酞菁基发色团，与质膜上的脂质结合，通过内吞作用内化，最终通过内吞途径积聚在溶酶体内¹⁸。它吸收近红外光谱区域内的光并产生单线态氧，这是由激发的AlPcS_2a¹⁸产生的主要ROS。单线态氧衰变迅速限制了其在细胞中微小区域（约10-20nm）内的扩散和反应距离¹⁹。通过调整AlPcS_2a 孵育和光照的持续时间，允许对亚细胞区域内IV的损伤进行时空控制。因此，CALI成为检查静脉损伤后果以及静脉注射形成和调节的有力工具。

在这项研究中，解决了使用_{AlPcS 2a} 作为光敏剂的CALI的特定方案。该方案可应用于各种类型的IV，包括内体和溶酶体，并用于检查膜破裂后的后续反应。表达溶酶体破裂后显示的荧光团缀合半乳糖凝集素-3^16，20 的HeLa细胞用于证明该方案。

Protocol

1. AlPcS2a 原液制备 将 10 mg AlPcS2a 溶解在 400 μL 的 0.1 M NaOH 中。为了提高溶解度，将溶液加热到50°C并涡旋。 将溶液与 4 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 混合。然后，用0.22μm过滤器过滤溶液以除去不溶性沉淀物。 通过紫外-可见分光光度计测量溶液的浓度。AlPcS2a在672 nm处的消光系数为4 x 104 cm-1 M-1。用PBS稀释AlPcS2a</su…

Representative Results

图中显示了AlPcS2a诱导的IV损伤，包括内体和溶酶体（图1）。 市售标记物可用于确定AlPcS2a 染色条件。例如，AlPcS2a 点和绿色荧光染料22 共定位（图2）。 荧光团标记的半乳糖凝集素-3可用作监测IV损伤的指示剂（图3）。此外，还可以跟踪Gal3点的位…

Discussion

AlPcS_2a 与质膜结合，然后通过内吞作用内化并最终积聚在溶酶体中。因此，_{AlPcS 2a} 可以通过调整孵育持续时间定位在亚细胞区室中。这种方法的局限性在于，只有 IV 亚群可以通过内吞作用被 AlPcS_2a 标记，因为还有许多其他 IV 膜源，例如 ER 和高尔基体装置。此外，将_{AlPcS 2a} 选择性标记到早期或晚期内体中具有挑战性，然而，荧光标记物可用于在亚细胞成像期间区分…

Materials

Reagent
Al(III) Phthalocyanine Chloride Disulfonic acid (AlPcS2a)	Frontier Scientific	P40632
Culture dish	ibidi	812128-200
Culture Medium			DMEM supplemented with 10% FBS and 100 U/mL penicillin G and 100 mg/mL Streptomycin
DMEM	Gibco	11965092
FBS	Thermo Fisher Scientific	A4736301
Gal3-GFP plasmid	addgene
Lipofectamine 3000 kit	Thermo Fisher Scientific	L3000008
LysoTracker Green DND-26	Thermo Fisher Scientific	L7526	green fluorescent dye
Multiwall plate	perkinelmer	PK-6005550
NaOH	Thermo Fisher Scientific	Q15895
OptiMEM	Thermo Fisher Scientific	31985070
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140163
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Gibco	21600-069	137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4
Cell line
HeLa Cell Line	ATCC	CCL-2	The methods are applicable for most of the attached cell lines. Conditions must be determined individually.
Equipments
0.22 µm Filter	Merck	SLGV013SL
Collimated LED Light  (660nm)	Thorlabs	M660L3-C1 and DC2100	Near-infared light is ideal base on the excitation spectrum of AlPcS2a.
Confocal microscopy	Carl Zeiss	LSM 780	An incubation system is required for long-term imaging.
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers	Thermo Fisher Scientific
Red LED light	Tholabs	M660L4-C1