AlPcS2a-mediert kromoforassistert laserinaktivering (CALI) er et kraftig verktøy for å studere spatiotemporal skade av intracellulære vesikler (IV) i levende celler.
Intracellulære vesikler (IV) dannes gjennom endocytose av vesikler til cytoplasma. IV-dannelse er involvert i aktivering av forskjellige signalveier gjennom permeabilisering av IV-membraner og dannelse av endosomer og lysosomer. En metode som kalles kromoforassistert laserinaktivering (CALI) brukes til å studere dannelsen av IV og materialene i å kontrollere IV-regulering. CALI er en bildebasert fotodynamisk metodikk for å studere signalveien indusert av membranpermeabilisering. Metoden tillater spatiotemporal manipulering av den valgte organellen som skal permeabiliseres i en celle. CALI-metoden har blitt brukt til å observere og overvåke spesifikke molekyler gjennom permeabilisering av endosomer og lysosomer. Membranbrudd av IVs er kjent for å selektivt rekruttere glykanbindende proteiner, slik som galektin-3. Her beskriver protokollen induksjon av IV-ruptur av AlPcS2a og bruk av galektin-3 som markør for å merke nedsatte lysosomer, noe som er nyttig for å studere nedstrømseffektene av IV-membranbrudd og deres nedstrømseffekter under ulike situasjoner.
Endosomer, en type intracellulær vesikkel (IV), dannes ved endocytose og modnes deretter til lysosomer. Ulike intracellulære signalveier er involvert i dannelsen av IVer; I tillegg kan forskjellige indre og ytre stimuli skade IVs (f.eks. patogener kan unnslippe fra den begrensede membranen under infeksjon og gå inn i cytoplasma1). Dette er vanligvis ledsaget av brudd på endocytotiske vesikler2. Derfor kan teknikkene for å målrette og skade IVs brukes i relaterte studier3.
Fotodynamisk terapi (PDT) er en lysavhengig terapi for å bekjempe sykdommer ved å drepe svulster eller patogener4. I PDT er målrettede celler merket med ikke-giftige kromoforer, kalt fotosensibilisatorer, som kan aktiveres lokalt ved lysbelysning 5,6. Fotosensibilisatorer absorberer energi fra lys og forvandles til en opphisset singlettilstand, noe som fører til den langlivede eksiterte trillingtilstanden. Fotosensibilisatorer av tripletttilstanden kan gjennomgå elektron- eller energioverføring og danne reaktive oksygenarter (ROS) i nærvær av oksygen, og kan romlig ødelegge merkede celler i belysningsområdet7. Konsekvensen varierer avhengig av lysets kraft8. Ved å kontrollere konsentrasjonen av fotosensibilisatorer og intensiteten av lysbelysning, kan målrettede biomolekyler selektivt inaktiveres uten cellelyse, betegnet som kromoforassistert lysinaktivering (CALI)9. Med den betydelige utviklingen av fotosensibilisatorer som selektivt kan merke forskjellige subcellulære mål, har CALI blitt et verdifullt verktøy for å kontrollere lysmediert inaktivering av biomolekyler for små biomolekyler som nukleotider og proteiner, samt organeller som mitokondrier og endo-lysosomer 3,10,11,12,13.
Sammenlignet med CALI brukes kjemiske eller fysiske metoder også for å svekke membraner, for eksempel bakteriell toksin 14,15 og Leu-Leu-OMe 16-behandling for lysosomal skade. Imidlertid viser disse metodene bulk svekkelse av IVs i celler. Robuste fotosensibilisatorer (dvs. Al(III)ftalocyaninkloriddisulfonsyre (AlPcS2a)) brukes i CALI; AlPcS2a, rettet mot lysosomene gjennom endocytose, brukes til å bryte endosomer eller lysosomer i et kontrollert område17. AlPcS2a er en cellemembran-ugjennomtrengelig ftalocyaninbasert kromofor som binder seg til lipid på plasmamembran og internaliseres gjennom endocytose og til slutt akkumuleres i lysosomet gjennom endocytisk vei18. Den absorberer lys i et nær-infrarødt spektralområde og genererer singlet oksygen, en stor ROS generert av eksitert AlPcS2a18. Singlet oksygenhenfall begrenser raskt diffusjons- og reaksjonsavstanden innenfor et lite område i celler (ca. 10-20 nm)19. Ved å justerevarigheten av AlPcS 2a-inkubasjon og lysbelysning, er spatiotemporal kontroll av skaden av IV innenfor et subcellulært område tillatt. CALI blir derfor et kraftig verktøy for å undersøke konsekvensene av IV-skade, og dannelse og regulering av IV.
I denne studien adresseres en spesifikk protokoll for CALI ved bruk av AlPcS2a som fotosensibilisator. Denne protokollen kan brukes på ulike typer IV, inkludert endosomer og lysosomer, og brukes til å undersøke oppfølgingsresponsene etter membranbrudd. HeLa-celler som uttrykker fluoroforkonjugert galektin-316,20 avslørt etter lysosomruptur, brukes til å demonstrere denne protokollen.
AlPcS2a binder seg til plasmamembranen, blir deretter internalisert ved endocytose og akkumuleres til slutt i lysosomer. AlPcS2a kan dermed lokaliseres i de subcellulære rommene ved å justere inkubasjonsvarigheten. En begrensning av denne metoden er at bare en underpopulasjon av IV kan merkes av AlPcS2a gjennom endocytose fordi det er mange andre membrankilder til IV, som ER og Golgi-apparater. I tillegg vil den selektive merkingen av AlPcS2a i tidlige eller sene endosomer v?…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Academia Sinica Inflammation Core Facility, IBMS for forskningsstøtte. Kjernefasiliteten er finansiert av Academia Sinica Core Facility and Innovative Instrument Project (AS-CFII-111-213). Forfatterne takker Common Equipment Core Facility ved Institute of Biomedical Sciences (IBMS), Academia Sinica (AS) for å hjelpe bildeoppkjøpet.
Reagent | |||
Al(III) Phthalocyanine Chloride Disulfonic acid (AlPcS2a) | Frontier Scientific | P40632 | |
Culture dish | ibidi | 812128-200 | |
Culture Medium | DMEM supplemented with 10% FBS and 100 U/mL penicillin G and 100 mg/mL Streptomycin | ||
DMEM | Gibco | 11965092 | |
FBS | Thermo Fisher Scientific | A4736301 | |
Gal3-GFP plasmid | addgene | ||
Lipofectamine 3000 kit | Thermo Fisher Scientific | L3000008 | |
LysoTracker Green DND-26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | green fluorescent dye |
Multiwall plate | perkinelmer | PK-6005550 | |
NaOH | Thermo Fisher Scientific | Q15895 | |
OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140163 | |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 21600-069 | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4 |
Cell line | |||
HeLa Cell Line | ATCC | CCL-2 | The methods are applicable for most of the attached cell lines. Conditions must be determined individually. |
Equipments | |||
0.22 µm Filter | Merck | SLGV013SL | |
Collimated LED Light (660nm) | Thorlabs | M660L3-C1 and DC2100 | Near-infared light is ideal base on the excitation spectrum of AlPcS2a. |
Confocal microscopy | Carl Zeiss | LSM 780 | An incubation system is required for long-term imaging. |
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ||
Red LED light | Tholabs | M660L4-C1 |