Ett fotodynamiskt tillvägagångssätt för att studera funktionen av intracellulärt vesikelbrott

Summary

AlPcS_2a-medierad kromoforassisterad laserinaktivering (CALI) är ett kraftfullt verktyg för att studera spatiotemporal skada av intracellulära vesiklar (IV) i levande celler.

Abstract

Intracellulära vesiklar (IV) bildas genom endocytos av vesiklar i cytoplasma. IV-bildning är involverad i aktivering av olika signalvägar genom permeabilisering av IV-membran och bildandet av endosomer och lysosomer. En metod som kallas kromoforassisterad laserinaktivering (CALI) används för att studera bildandet av intravenösa läkemedel och materialen vid styrning av intravenös reglering. CALI är en bildbaserad fotodynamisk metod för att studera signalvägen inducerad av membranpermeabilisering. Metoden tillåter spatiotemporal manipulation av den valda organellen att permeabiliseras i en cell. CALI-metoden har tillämpats för att observera och övervaka specifika molekyler genom permeabilisering av endosomer och lysosomer. Membranbrottet av IV är känt för att selektivt rekrytera glykanbindande proteiner, såsom galectin-3. Här beskriver protokollet induktionen av IV-ruptur av AlPcS_2a och användningen av galectin-3 som en markör för att märka nedsatta lysosomer, vilket är användbart för att studera nedströmseffekterna av IV-membranbrott och deras nedströmseffekter under olika situationer.

Introduction

Endosomer, en typ av intracellulär vesikel (IV), bildas av endocytos och mognar sedan till lysosomer. Olika intracellulära signalvägar är involverade i bildandet av IV; Dessutom kan olika inneboende och yttre stimuli skada IV (t.ex. patogener kan fly från det avgränsade membranet under infektion och gå in i cytoplasma¹). Detta åtföljs vanligtvis av bristning av endocytotiska vesiklar². Därför kan teknikerna för inriktning och skada IV användas i relaterade studier³.

Fotodynamisk terapi (PDT) är en ljusberoende terapi för att bekämpa sjukdomar genom att döda tumörer eller patogener⁴. I PDT är riktade celler märkta med giftfria kromoforer, kallade fotosensibiliserare, som kan aktiveras lokalt med ljusbelysning ^5,6. Fotosensibilisatorer absorberar energi från ljus och omvandlas till ett exciterat singletttillstånd, vilket leder till det långlivade exciterade tripletttillståndet. Fotosensibilisatorer i tripletttillståndet kan genomgå elektron- eller energiöverföring och bilda reaktiva syrearter (ROS) i närvaro av syre och kan rumsligt förstöra märkta celler inom belysningsområdet⁷. Konsekvensen varierar beroende på ljusets kraft⁸. Genom att kontrollera koncentrationen av fotosensibilisatorer och intensiteten hos ljusbelysning kan riktade biomolekyler selektivt inaktiveras utan celllys, benämnd kromoforassisterad ljusinaktivering (CALI)⁹. Med den betydande utvecklingen av fotosensibilisatorer som selektivt kan märka olika subcellulära mål har CALI blivit ett värdefullt verktyg för att kontrollera ljusmedierad inaktivering av biomolekyler för små biomolekyler såsom nukleotider och proteiner, liksom organeller såsom mitokondrier och endososomer 3,10,11,12,13.

Jämfört med Cali används kemiska eller fysiska metoder också för att försämra membran, såsom bakterietoxin ^14,15 och Leu-Leu-OMe ^{16-behandling} för lysosomal skada. Dessa metoder visar emellertid bulkförsämring av IV i celler. Robusta fotosensibilisatorer (dvs. Al(III)ftalocyaninkloriddisulfonsyra (AlPcS_2a)) används i CALI; AlPcS 2a, som riktar sig mot lysosomerna genom endocytos, används för att_brista endosomer eller lysosomer i en kontrollerad region¹⁷. AlPcS_2a är en cellmembranogenomtränglig ftalocyaninbaserad kromofor som binder till lipid på plasmamembran och internaliseras genom endocytos och ackumuleras så småningom i lysosomen genom den endocytiska vägen¹⁸. Det absorberar ljus inom ett nära infrarött spektralområde och genererar singlettsyre, en viktig ROS som genereras av exciterad AlPcS_2a¹⁸. Singlettsyresönderfall begränsar snabbt dess diffusions- och reaktionsavstånd inom ett litet område i celler (ungefär 10-20 nm)¹⁹. Genom att justera_{varaktigheten} av AlPcS 2a-inkubation och ljusbelysning tillåts spatiotemporal kontroll av skadorna på IV inom ett subcellulärt område. CALI blir därför ett kraftfullt verktyg för att undersöka konsekvenserna av IV-skador och bildandet och regleringen av IV.

I denna studie behandlas ett specifikt protokoll för CALI som använder AlPcS_2a som fotosensibiliserare. Detta protokoll kan tillämpas på olika typer av IV, inklusive endosomer och lysosomer, och används för att undersöka uppföljningssvaren efter membranbrott. HeLa-celler som uttrycker fluoroforkonjugerat galectin-3^16,20 som avslöjats efter lysosombrott används för att demonstrera detta protokoll.

Protocol

1. AlPcS2a lagerberedning Lös 10 mg AlPcS2a i 400 μl 0,1 M NaOH. För att förbättra lösligheten, värm lösningen vid 50 °C och virvel. Blanda lösningen med 4 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Filtrera sedan lösningen med ett 0,22 μm filter för att avlägsna de olösliga fällningarna. Mät lösningens koncentration genom en UV-Vis-spektrofotometer. Extinktionskoefficienten för AlPcS2a vid 672 nm är 4 x 104 cm-1 <sup…

Representative Results

En schematisk figur som representerar AlPcS2a-inducerad skada av IV, inklusive endosom och lysosom, har visats (figur 1). Kommersiellt tillgängliga markörer kan användas för att bestämma färgningsförhållandena för AlPcS2a. Till exempel AlPcS2a puncta och grönt fluorescerande färgämne22 samlokalisering (figur 2). Fluoroformärkt galectin-3 …

Discussion

AlPcS_2a binder till plasmamembranet, internaliseras sedan av endocytos och ackumuleras så småningom i lysosomer. AlPcS_2a kan således lokaliseras i de subcellulära facken genom att justera inkubationstiden. En begränsning av denna metod är att endast en subpopulation av IV kan märkas av AlPcS_2a genom endocytos eftersom det finns många andra membrankällor för IV, såsom ER och Golgi-apparater. Dessutom skulle den selektiva märkningen av AlPcS 2a i tidiga eller_sena endo…

Materials

Reagent
Al(III) Phthalocyanine Chloride Disulfonic acid (AlPcS2a)	Frontier Scientific	P40632
Culture dish	ibidi	812128-200
Culture Medium			DMEM supplemented with 10% FBS and 100 U/mL penicillin G and 100 mg/mL Streptomycin
DMEM	Gibco	11965092
FBS	Thermo Fisher Scientific	A4736301
Gal3-GFP plasmid	addgene
Lipofectamine 3000 kit	Thermo Fisher Scientific	L3000008
LysoTracker Green DND-26	Thermo Fisher Scientific	L7526	green fluorescent dye
Multiwall plate	perkinelmer	PK-6005550
NaOH	Thermo Fisher Scientific	Q15895
OptiMEM	Thermo Fisher Scientific	31985070
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140163
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Gibco	21600-069	137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4
Cell line
HeLa Cell Line	ATCC	CCL-2	The methods are applicable for most of the attached cell lines. Conditions must be determined individually.
Equipments
0.22 µm Filter	Merck	SLGV013SL
Collimated LED Light  (660nm)	Thorlabs	M660L3-C1 and DC2100	Near-infared light is ideal base on the excitation spectrum of AlPcS2a.
Confocal microscopy	Carl Zeiss	LSM 780	An incubation system is required for long-term imaging.
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers	Thermo Fisher Scientific
Red LED light	Tholabs	M660L4-C1