यह प्रोटोकॉल एक वयस्क माउस से प्राप्त रेटिना खोजों के अलगाव, विच्छेदन, संवर्धन और धुंधलापन के लिए चरणों को प्रस्तुत और वर्णित करता है। यह विधि विभिन्न रेटिना न्यूरोवास्कुलर रोगों जैसे मधुमेह रेटिनोपैथी का अध्ययन करने के लिए एक पूर्व विवो मॉडल के रूप में फायदेमंद है।
रेटिना अनुसंधान में चुनौतियों में से एक रेटिना न्यूरॉन्स, ग्लियल कोशिकाओं और संवहनी कोशिकाओं जैसे विभिन्न रेटिना कोशिकाओं के बीच क्रॉस-टॉक का अध्ययन कर रहा है। विट्रो में रेटिना न्यूरॉन्स को अलग करना, संवर्धन करना और बनाए रखना तकनीकी और जैविक सीमाएं हैं। रेटिना खोजों की खेती इन सीमाओं को दूर कर सकती है और अच्छी तरह से नियंत्रित जैव रासायनिक मापदंडों और संवहनी प्रणाली से स्वतंत्र विभिन्न रेटिना कोशिकाओं के बीच क्रॉस-टॉक का अध्ययन करने के लिए एक अद्वितीय पूर्व विवो मॉडल प्रदान कर सकती है। इसके अलावा, रेटिना एक्सप्लेंट विभिन्न रेटिना संवहनी और न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों जैसे मधुमेह रेटिनोपैथी में नए औषधीय हस्तक्षेपों का अध्ययन करने के लिए एक प्रभावी स्क्रीनिंग टूल है। यहां, हम एक विस्तारित अवधि के लिए रेटिना खोजों के अलगाव और संस्कृति के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। पांडुलिपि इस प्रक्रिया के दौरान कुछ तकनीकी समस्याओं को भी प्रस्तुत करती है जो रेटिना खोज संस्कृति के वांछित परिणामों और प्रजनन क्षमता को प्रभावित कर सकती हैं। रेटिना एक्सप्लेंट कल्चर की शुरुआत से 2 सप्ताह के बाद रेटिना वाहिकाओं, ग्लियल कोशिकाओं और न्यूरॉन्स के इम्यूनोस्टेनिंग ने बरकरार रेटिना केशिकाओं और न्यूरोग्लियल कोशिकाओं का प्रदर्शन किया। यह रेटिना वास्कुलचर और न्यूरोग्लियल कोशिकाओं में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए एक विश्वसनीय उपकरण के रूप में रेटिना खोजों को स्थापित करता है जो मधुमेह रेटिनोपैथी जैसे रेटिना रोगों की नकल करते हैं।
रेटिना रोगों का अध्ययन करने के लिए विभिन्न मॉडल प्रस्तुत किए गए हैं, जिनमें विवो और इन विट्रो मॉडल दोनों शामिल हैं। अनुसंधान में जानवरों का उपयोग अभी भी निरंतर नैतिक और अनुवाद बहस का विषय है। चूहों या चूहों जैसे कृन्तकों को शामिल करने वाले पशु मॉडल आमतौर पर रेटिना अनुसंधान 2,3,4 में उपयोग किए जाते हैं। हालांकि, मनुष्यों की तुलना में कृन्तकों में रेटिना के विभिन्न शारीरिक कार्यों के कारण नैदानिक चिंताएं उत्पन्न हुई हैं, जैसे कि मैक्यूला की अनुपस्थिति या रंग दृष्टि5 में अंतर। रेटिना अनुसंधान के लिए मानव पोस्टमॉर्टम आंखों के उपयोग में भी कई समस्याएं हैं, जिनमें मूल नमूनों की आनुवंशिक पृष्ठभूमि, दाताओं के चिकित्सा इतिहास और दाताओं के पिछले वातावरण या जीवन शैली में अंतरशामिल हैं। इसके अलावा, रेटिना अनुसंधान में इन विट्रो मॉडल के उपयोग में कुछ कमियां भी हैं। रेटिना रोगों का अध्ययन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले सेल कल्चर मॉडल में मानव मूल, प्राथमिक कोशिकाओं या स्टेम कोशिकाओं की सेल लाइनों का उपयोग शामिलहै। उपयोग किए गए सेल कल्चर मॉडल को दूषित, गलत पहचान, या 8,9,10,11 के संदर्भ में समस्याएं दिखाई गई हैं। हाल ही में, रेटिना ऑर्गेनॉइड तकनीक ने महत्वपूर्ण प्रगति दिखाई है। हालांकि, विट्रो में अत्यधिक जटिल रेटिना के निर्माण की कई सीमाएं हैं। उदाहरण के लिए, रेटिना ऑर्गेनोइड्स में विवो रेटिना में परिपक्व होने के समान शारीरिक और जैव रासायनिक विशेषताएं नहीं होती हैं। इस सीमा को दूर करने के लिए, रेटिना ऑर्गेनॉइड तकनीक को अधिक जैविक और सेलुलर विशेषताओं को एकीकृत करना चाहिए, जिसमें चिकनी मांसपेशी कोशिकाएं, वाहिका और माइक्रोग्लिया 12,13,14,15 जैसी प्रतिरक्षा कोशिकाएं शामिल हैं।
ऑर्गेनोटाइपिक रेटिना एक्सप्लेंट ्स रेटिना रोगों जैसे मधुमेह रेटिनोपैथी और अपक्षयी रेटिनारोगों का अध्ययन करने के लिए एक विश्वसनीय उपकरण के रूप में उभरे हैं। अन्य मौजूदा तकनीकों की तुलना में, रेटिना एक्सप्लेंट का उपयोग इन विट्रो रेटिना सेल संस्कृतियों का समर्थन करता है और विवो पशु मॉडल में भी एक ही जैव रासायनिक मापदंडों के तहत विभिन्न रेटिना कोशिकाओं के बीच क्रॉस-टॉक का अध्ययन करने के लिए एक अनूठी विशेषता जोड़कर और प्रणालीगत चर से स्वतंत्र है। खोज संस्कृतियां विभिन्न रेटिना कोशिकाओं को एक ही वातावरण में एक साथ रखने की अनुमति देती हैं, जिससे रेटिना इंटरसेलुलर इंटरैक्शन 20,21,22 के संरक्षण की अनुमति मिलती है। इसके अलावा, एक पिछले अध्ययन से पता चला है कि रेटिना खोज सुसंस्कृत रेटिना कोशिकाओंकी रूपात्मक संरचना और कार्यक्षमता को संरक्षित करने में सक्षम थे। इस प्रकार, रेटिना खोज विभिन्न प्रकार के रेटिना रोगों24,25,26 के लिए संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों की जांच के लिए एक सभ्य मंच प्रदान कर सकती है। रेटिना खोज संस्कृतियां एक नियंत्रणीय तकनीक प्रदान करती हैं और मौजूदा मोथोड के लिए बहुत लचीली विकल्प हैं जो कई औषधीय जोड़तोड़ की अनुमति देती हैं और कई आणविकतंत्रों को उजागर कर सकती हैं।
इस पेपर का समग्र लक्ष्य इन विट्रो सेल संस्कृतियों और विवो पशु मॉडल के बीच एक उचित मध्यवर्ती मॉडल प्रणाली के रूप में रेटिना खोज तकनीक को प्रस्तुत करना है। यह तकनीक अलग-थलग कोशिकाओं की तुलना में रेटिना कार्यों की बेहतर तरीके से नकल कर सकती है। चूंकि विभिन्न रेटिना परतें बरकरार रहती हैं, रेटिना इंटरसेलुलर इंटरैक्शन का मूल्यांकन प्रयोगशाला में अच्छी तरह से नियंत्रित जैव रासायनिक स्थितियों के तहत और संवहनी प्रणाली के कामकाज से स्वतंत्र किया जा सकताहै।
हमारी प्रयोगशाला पैथोफिजियोलॉजिकल परिवर्तनों का अध्ययन कर रही है जोवर्षों 31,32,33,34,35,36 के लिए रेटिना माइक्रोवैस्कुलर डिसफंक्शन को बढ़ावा देत?…
The authors have nothing to disclose.
हम डॉ मोहम्मद अल-शबरावे को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (एनआईएच) फंडिंग ग्रांट को धन्यवाद देना चाहते हैं। हम वीडियो वर्णन के साथ हमारी मदद करने के लिए कैथी वोलोसीविक्ज़ को धन्यवाद देना चाहते हैं। हम सर्जिकल माइक्रोस्कोप और रिकॉर्डिंग के उपयोग के दौरान उनकी मदद के लिए नेत्र अनुसंधान संस्थान के बाल चिकित्सा रेटिना अनुसंधान प्रयोगशाला, ओकलैंड विश्वविद्यालय के डॉ केन मिटन को धन्यवाद देना चाहते हैं। इस वीडियो को डॉ खालिद एल्मासरी ने संपादित और निर्देशित किया था।
Adult C57Bl/6J mice | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, 04609, USA | 664 | |
All-in-One Fluorescence Microscope | KEYENCE CORPORATION OF AMERICA, IL, 60143, U.S.A. | BZ-X800 | |
B27 supplements | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | Gibco #17504-04 | |
Blockade blocking solution | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | B10710 | |
DMEM F12 | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | Gibco #11320033 | |
Goat anti-Rabbit IgG. | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | F-2765 | |
GSL I, BSL I (Isolectin) | Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA | B-1105-2 | |
Hanks Ballanced Salt Solution (HBSS) | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | Gibco #14175095 | |
Micro Scissors, 12 cm, Diamond Coated Blades | World Precision Instruments,FL 34240, USA | Straight (503365) | |
N2 supplements | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | Gibco #17502-048 | |
Nunc Polycarbonate Cell Culture Inserts in Multi-Well Plates | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | 140652 | |
Paraformaldehyde 4% in PBS | BBP, Ashland, MA, 01721 USA | C25N107 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | 15140148 | |
PROLONG DIAMOND ANTIFADE 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). | Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA | P36962 | |
Rabbit Anti-NeuN Antibody | Abcam.,Cambridge, UK | ab177487 | |
Rabbit Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody | Dako,Carpinteria, CA 93013, USA. | Z0334 | |
Texas Red | Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA | SA-5006-1 | |
TritonX | BioRad Hercules, CA, 94547,USA | 1610407 |