تصنيع الميكروسفير المسامي المفتوح للغاية (HOPMs) عبر تقنية الموائع الدقيقة
Summary
يصف هذا البروتوكول تصنيع الميكروسفير المسامي عالي الانفتاح القائم على البولي (حمض اللاكتيك – كو غليكوليك) (HOPMs) عبر تقنية الموائع الدقيقة السطحية القائمة على صيغة مستحلب واحد. هذه الميكروسفير لها تطبيقات محتملة في هندسة الأنسجة وفحص الأدوية.
Abstract
بالمقارنة مع السقالات السائبة والحقن المباشر للخلايا وحدها ، اكتسبت الوحدات المعيارية القابلة للحقن اهتماما هائلا بإصلاح الأنسجة المعطلة، بسبب الراحة في تغليف الخلايا، وتحسين الاحتفاظ بالخلايا، والحد الأدنى من التوغل. علاوة على ذلك ، يمكن أن يؤدي التشكيل المسامي لهذه الناقلات الدقيقة إلى تعزيز التبادل المتوسط وتحسين مستوى العناصر الغذائية وإمدادات الأكسجين. توضح هذه الدراسة التصنيع المريح للميكروسفير المسامي عالي الانفتاح القائم على البولي (حمض اللاكتيك – كو غليكوليك) (PLGA-HOPMs) بواسطة تقنية الموائع الدقيقة السهلة لتطبيقات توصيل الخلايا. تمتلك PLGA-HOPMs أحادية التشتت الناتجة أحجام جسيمات ~ 400 ميكرومتر ومسام مفتوحة تبلغ ~ 50 ميكرومتر مع نوافذ متصلة. باختصار ، تم إدخال قطرات الزيت المستحلب (محلول PLGA في ثنائي كلورو الميثان ، DCM) ، ملفوفة بمرحلة الجيلاتين المائية 7.5٪ (w / v) ، في محلول مائي متعدد (كحول الفينيل) (PVA) متدفق باستمرار بنسبة 1٪ (w / v) من خلال الفوهة المحورية في إعداد الموائع الدقيقة المخصصة. وفي وقت لاحق، خضعت الميكروسفير لإجراءات استخراج المذيبات والتجفيد، مما أدى إلى إنتاج HOPMs. ومن الجدير بالذكر أن التركيبات المختلفة (تركيزات PLGA والبوروجين) ومعلمات المعالجة (قوة الاستحلاب ، ومقياس الإبرة ، ومعدل تدفق الطور المشتت) تلعب أدوارا حاسمة في صفات وخصائص PLGA HOPMs الناتجة. علاوة على ذلك، قد تغلف هذه البنى العديد من الإشارات الكيميائية الحيوية الأخرى، مثل عوامل النمو، لاكتشاف الأدوية الموسعة وتطبيقات تجديد الأنسجة.
Introduction
توفر الميكروسفير المحملة بالخلايا مزايا مواتية ، مثل تعزيز قدرة الاحتفاظ بالخلايا في الموقع ، والتسليم الفعال للخلايا ، والقدرة اللاحقة على تكاثر الخلايا في الجسم الحي1. حتى الآن ، تم طرح العديد من التحقيقات لتطوير هيكل سقالات ناجح لدعم بيئة مواتية للخلايا لتجديد الأنسجة أو تطبيقات فحص الأدوية2. ومع ذلك ، فإن بيئة نقص الأكسجة غالبا ما تكون حتمية في المناطق الداخلية بسبب عدم كفاية إمدادات العناصر الغذائية / الأكسجين وتراكم النفايات الأيضية3. للتغلب على هذه المشاكل ، تم تطوير الميكروسفير المسامي للغاية (PMs) باستخدام مواد حيوية مختلفة4،5،6. بالإضافة إلى ذلك ، في الثقافة الديناميكية ، تعاني السقالات من إجهاد القص المفرط7 ، وقد تكسر الحالة غير المستقرة لوسط الاستزراع إخلاص PMs. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام poly (حمض اللاكتيك – co-glycolic) (PLGA) لمعالجة PMs بقوة ميكانيكية جيدة للثقافة الديناميكية1. على سبيل المثال ، أظهرنا الحقن المشترك للفأر myoblast (C2C12) المحمل ب PLGA PMs (HOPMs) والخلية البطانية الوريدية السري البشرية (HUVEC) المحملة بالبولي (الإيثيلين غليكول) المجوفة لعلاج فقدان العضلات الحجمي ، وتحقيق تحسن ملحوظ في تجديد العضلات الهيكلية في الموقع 8.
والجدير بالذكر أن PMs تتميز بمساحات سطحية كبيرة ومساميات عالية ، وهو أمر ذو أهمية خاصة لالتصاق الخلايا ونموها نحو توصيل الخلايا طفيفة التوغل9. في ضوء هذه الجوانب ، تم استخدام العديد من المواد المتوافقة بيولوجيا لتصنيع PMs10,11. توفر هذه PMs القابلة للتصميم والمزروعة بالخلايا التصاق ممتاز ، وقوة ميكانيكية كبيرة ، ونوافذ مترابطة للغاية ، والتي يمكن أن تحسن تكاثر الخلايا لإصلاح الأنسجة التالفة12. في هذا الصدد ، تم تطوير تقنيات مختلفة أيضا لتصنيع المجالات المسامية13,14. من ناحية ، تم إنتاج PMs باستخدام عوامل تشكيل الغاز ، مثل NH4HCO3 ، والتي تم تقييدها بسبب عدم كفاية الترابط15،16،17. من ناحية أخرى ، تم قص PMs مباشرة بعد الاستحلاب ، مما أدى إلى PMs18 متعدد التشتت. في النهاية ، ربما تكون تقنية الموائع الدقيقة القطيرة القائمة على نهج الاستحلاب طريقة فعالة لبناء PMs ، لأنها غالبا ما تؤدي إلى جزيئات موحدة الحجم19. والجدير بالذكر أن السمات المورفولوجية للميكروسفير غالبا ما تعتمد على جودة قطرات المستحلب المتولدة (أي الماء في الزيت ، W / O ، أو الزيت في الماء ، O / W) ، والتي قد تؤثر بشكل كبير على سمات المواد الحيوية20. تجدر الإشارة إلى أنه يمكن تطبيق منصة الموائع الدقيقة المصممة مسبقا لتوليد الألياف الدقيقة أو الميكروسفيرات. في إحدى الحالات ، أظهر Yu et al. إنتاج هياكل ليفية دقيقة محملة بالخلايا تعتمد على منصات الموائع الدقيقة القائمة على الشعيرات الدموية ، والتي يمكن استخدامها لتجميع الشبكات الخلوية لمحاكاة الأنسجة الطبيعية21. وفي حالة أخرى، قام يي وآخرون بتصنيع كبسولات ميكروكبسولات بلورية فوتونية عن طريق تكرار القالب لخرز الكريستال الغروي السيليكا من خلال تكنولوجيات الموائع الدقيقة، والتي يمكن أن تتغلب على العديد من القيود المفروضة على التقنيات الحالية التي تتطلب وضع علامات معقدة وأجهزة محددة22.
والواقع أن الأساس المنطقي وراء استخدام هذه التقنية يرجع إلى مزايا مختلفة، مثل كونها سهلة في طبيعتها، ولا تتطلب معدات متطورة، وملاءمتها في توليف أجهزة إدارة المشاريع موحدة الحجم لتوصيل الخلايا وتطبيقات الطب التجديدي. في هذا السياق ، مع المكونات المصممة مسبقا لمحاكاة المستحلب ، يمكن الحصول على PMs ذات المساميات العالية والترابط بسهولة من جهاز microfluidic تم تجميعه من أنابيب poly (vinyl chloride) (PVC) ، والشعيرات الدموية الزجاجية ، وإبرة. يتم تحضير سلائف مستحلب W/O عن طريق تجانس محلول مائي من الجيلاتين ومحلول عضوي من PLGA. من خلال حقن الجزء القابل للتطبيق من المستحلب بشكل انتقائي في منصة الموائع الدقيقة ، يتم تصنيع PMs ذات أحجام الجسيمات الموحدة والمسام المترابطة في جميع أنحاء السطح إلى الداخل. يهدف هذا البروتوكول إلى تصنيع PLGA-HOPMs عن طريق الاستحلاب في منصة الموائع الدقيقة. ويعتقد أن هذا البروتوكول يسمح بإنتاج PLGA-HOPMs قابل للتكرار ومن المحتمل أن يكون قابلا للتطبيق في المجالات ذات الصلة بهندسة الأنسجة وفحص الأدوية.
Protocol
Representative Results
Discussion
توضح هذه المقالة استراتيجية فعالة لتصنيع البنى المستندة إلى PLGA، وهي PLGA-HOPMs. تجدر الإشارة إلى أنه يجب اتخاذ العديد من الخطوات الحاسمة بعناية ، بما في ذلك تجنب تطاير المذيبات من PLGA والتعديل اللطيف للطاقة فوق الصوتية إلى الموضع المستهدف أثناء إعداد المستحلب. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تعديل الم?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تعترف SCL و YW و RKK و AZC بالدعم المالي المقدم من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (NSFC و 32071323 و 81971734 و U1605225) وبرنامج فريق البحث المبتكر في العلوم والتكنولوجيا في جامعة مقاطعة فوجيان. لم تكن YSZ مدعومة بأي من هذه البرامج ولم تتلق مدفوعات من أي نوع ؛ بدلا من ذلك ، يتم الاعتراف بالدعم المقدم من معهد بريغهام للأبحاث.
Materials
| Centrifuge tube | Solarbio, Beijing, China | 5 mL & 50 mL (sterility) | |
| Confocal laser scanning microscopy | Leica, Wetzlar, Germany | TCS SP8 | |
| Dichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China | 20161110 | Research Grade |
| Dispensing needle | Kindly, Shanghai, China | 26 G, ID: 250 μm, OD: 460 μm | |
| DMEM/F-12 | Gibco; Life Technologies Corporation, Calsbad, USA | 15400054 | DMEM/F-12 50/50, 1x (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine |
| Ethyl alcohol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, Shanghai, China | 20210918 | Research Grade |
| Ethyl-enediaminetetraacetic acid (EDTA)-trypsin | Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra | Trypsin (0.25%), EDTA (0.02%) | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra | Research Grade | |
| Freeze drier | Bilon, Shanghai, China | FD-1B-50 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA | lot# SZBF2870V | From porcine skin, Type A |
| Glass bottom plate | Biosharp, Hefei, China | BS-15-GJM, 35 mm | |
| Glass capillary | Huaou, Jiangsu, China | 0.9-1.1 × 120 mm | |
| Incubator shaker | Zhicheng, Shanghai, China | ZWYR-200D | |
| Live dead kit cell imaging kit | Solarbio, Beijing, China | 60421211112 | Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm) |
| Low-speed centrifuge | Xiangyi, Hunan, China | TD5A | |
| Magnetron sputter | Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China | MSP-2S | |
| Microflow injection pump | Harvard Apparatus, Holliston, USA | Harvard Pump 11 Plus | |
| Penicillin-streptomycin | Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Isra | 2135250 | Research Grade |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Servicebio Technology Co.,Ltd. Wuhan, China | GP21090181556 | PBS 1x, culture grade, no Calcium, no Magnesium |
| Poly(lactic-co-glycolic acid) | Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA | lot# MKCF9651 | 66–107 kDa, lactide:glycolide 75:25 |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich Co. Ltd, St. Louis, USA | lot# MKCK4266 | 13-13 kDa, 98% Hydrolyzed |
| PVC tube | Shenchen, Shanghai, China | Inner diameter, ID: 1 mm | |
| Rat bone marrow mesenchyml stem cells | Procell, Wuhan, China | ||
| Scanning electron microscope | Phenom pure, Eindhoven, Netherlands | Set acceleration voltage at 5 kV | |
| Syrine for medical purpose | Kindly, Shanghai, China | 5 mL & 50 mL (with the needle) | |
| Temperature water bath | Mingxiang, Shenzhen, China | 36 W | |
| Transformer | Riye electric Co. Ltd, Suzhou, China | SZ-2KVA | |
| Ultrasonic cell breaker | JY 92-IID, Scientz, Ningbo, China | JY 92-IID | |
| UV curing glue | Zhuolide, Foshan, China | D-3100 |
References
- Kankala, R. K., et al. Highly porous microcarriers for minimally invasive in situ skeletal muscle cell delivery. Small. 15 (25), 1901397 (2019).
- Wang, Y., et al. Modeling endothelialized hepatic tumor microtissues for drug screening. Advanced Science. 7 (21), 2002002 (2020).
- Li, Q., et al. Tripeptide-based macroporous hydrogel improves the osteogenic microenvironment of stem cells. Journal of Materials Chemistry B. 9 (30), 6056-6067 (2021).
- Liu, Y., et al. PLGA hybrid porous microspheres as human periodontal ligament stem cell delivery carriers for periodontal regeneration. Chemical Engineering Journal. 420, 129703 (2021).
- Wei, P., Xu, Y., Zhang, H., Wang, L. Continued sustained insulin-releasing PLGA nanoparticles modified 3D-printed PCL composite scaffolds for osteochondral repair. Chemical Engineering Journal. 422, 130051 (2021).
- Sang, S., et al. Biocompatible chitosan/polyethylene glycol/multi-walled carbon nanotube composite scaffolds for neural tissue engineering. Journal of Zhejiang University-Science B. 23 (1), 58-73 (2022).
- Ghasemian, M., et al. Hydrodynamic characterization within a spinner flask and a rotary wall vessel for stem cell culture. Biochemical Engineering Journal. 157, 107533 (2020).
- Wang, Y., et al. Minimally invasive co-injection of modular micro-muscular and micro-vascular tissues improves in situ skeletal muscle regeneration. Biomaterials. 277, 121072 (2021).
- Kang, S. W., Bae, Y. H. Cryopreservable and tumorigenic three-dimensional tumor culture in porous poly(lactic-co-glycolic acid) microsphere. Biomaterials. 30 (25), 4227-4232 (2009).
- Fan, D., et al. Mesoporous silicon-PLGA composite microspheres for the double controlled release of biomolecules for orthopedic tissue Engineering. Advanced Functional Materials. 22 (2), 282-293 (2012).
- Xu, Y., et al. Metabolism balance regulation via antagonist-functionalized injectable microsphere for nucleus pulposus regeneration. Advanced Functional Materials. 30 (52), 2006333 (2020).
- Yao, R., Zhang, R., Lin, F., Luan, J. Injectable cell/hydrogel microspheres induce the formation of fat lobule-like microtissues and vascularized adipose tissue regeneration. Biofabrication. 4 (4), 045003 (2012).
- Sikavitsas, V. I., Bancroft, G. N., Mikos, A. G. Formation of three-dimensional cell/polymer constructs for bone tissue engineering in a spinner flask and a rotating wall vessel bioreactor. Journal of Biomedical Materials Research. 62 (1), 136-148 (2002).
- Kim, T. K., Yoon, J. J., Lee, D. S., Park, T. G. Gas foamed open porous biodegradable polymeric microspheres. Biomaterials. 27 (2), 152-159 (2006).
- Wang, C. Y., Liao, H. F., Sheu, D. C. Enhancement of recombinant human macrophage colony-stimulating factor production using culture systems with porous polymeric microspheres. Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers. 41 (2), 203-208 (2010).
- Amoyav, B., Benny, O. Microfluidic based fabrication and characterization of highly porous polymeric microspheres. Polymers. 11 (3), 419 (2019).
- Zhang, H., et al. Microfluidic fabrication of inhalable large porous microspheres loaded with H2S-releasing aspirin derivative for pulmonary arterial hypertension therapy. Journal of Controlled Release. 329, 286-298 (2021).
- Qu, M., et al. Injectable open-porous PLGA microspheres as cell carriers for cartilage regeneration. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 109 (11), 2091-2100 (2021).
- Zheng, Y., et al. Microfluidic droplet-based functional materials for cell manipulation. Lab on a Chip. 21 (22), 4311-4329 (2021).
- Kawakatsu, T., Kikuchi, Y., Nakajima, M. Regular-sized cell creation in microchannel emulsification by visual microprocessing method. Journal of the American Oil Chemists’ Society. 74 (3), 317-321 (1997).
- Yu, Y., Shang, L., Guo, J., Wang, J., Zhao, Y. Design of capillary microfluidics for spinning cell-laden microfibers. Nature Protocols. 13 (11), 2557-2579 (2018).
- Ye, B., et al. Photonic crystal microcapsules for label-free multiplex detection. Advanced Materials. 26 (20), 3270-3274 (2014).
- Zhong, Z., et al. Zn/Sr dual ions-collagen co-assembly hydroxyapatite enhances bone regeneration through procedural osteo-immunomodulation and osteogenesis. Bioactive Materials. 10, 195-206 (2022).
- Poole, C. A., Brookes, N. H., Clover, G. M. Keratocyte networks visualized in the living cornea using vital dyes. Journal of Cell Science. 106 (2), 685-692 (1993).
- Gentile, P., Chiono, V., Carmagnola, I., Hatton, P. V. An overview of poly(lactic-co-glycolic) acid (PLGA)-based biomaterials for bone tissue engineering. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 3640-3659 (2014).
- Lanao, R. P. F., et al. Physicochemical properties and applications of Poly(lactic-co-glycolic acid) for use in bone regeneration. Tissue Engineering Part B-Reviews. 19 (4), 380-390 (2013).
