Dit protocol beschrijft de isolatie van muis preadipocyten uit onderhuids vet, hun differentiatie in volwassen adipocyten en de inductie van insulineresistentie. De werking van insuline wordt geëvalueerd door de fosforylering/activering van leden van de insulinesignaleringsroute door western blot. Deze methode maakt directe bepaling van insulineresistentie/gevoeligheid in primaire adipocyten mogelijk.
Insulineresistentie is een verminderd effect van insuline op de doelcellen, meestal afgeleid van verminderde insulinereceptorsignalering. Insulineresistentie draagt bij aan de ontwikkeling van diabetes type 2 (T2D) en andere van obesitas afgeleide ziekten met een hoge prevalentie wereldwijd. Daarom is het begrijpen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan insulineresistentie van groot belang. Verschillende modellen zijn gebruikt om insulineresistentie zowel in vivo als in vitro te bestuderen; Primaire adipocyten vormen een aantrekkelijke optie om de mechanismen van insulineresistentie te bestuderen en moleculen te identificeren die deze aandoening tegengaan en de moleculaire doelen van insuline-sensibiliserende geneesmiddelen. Hier hebben we een insulineresistentiemodel opgesteld met behulp van primaire adipocyten in cultuur behandeld met tumornecrosefactor-α (TNF-α).
Adipocytenvoorlopercellen (APC’s), geïsoleerd uit collagenase-verteerd onderhuids vetweefsel van muizen door magnetische celscheidingstechnologie, worden gedifferentieerd in primaire adipocyten. Insulineresistentie wordt vervolgens geïnduceerd door behandeling met TNF-α, een pro-inflammatoir cytokine dat de tyrosinefosforylering / activering van leden van de insulinesignaleringscascade vermindert. Verminderde fosforylering van insulinereceptor (IR), insulinereceptorsubstraat (IRS-1) en eiwitkinase B (AKT) worden gekwantificeerd door western blot. Deze methode biedt een uitstekend hulpmiddel om de mechanismen te bestuderen die insulineresistentie in vetweefsel bemiddelen.
Insuline is een anabolisch hormoon geproduceerd door pancreas eilandje β-cellen en de belangrijkste regulator van glucose en lipiden metabolisme. Onder de vele functies reguleert insuline de opname van glucose, glycogeensynthese, gluconeogenese, eiwitsynthese, lipogenese en lipolyse1. Het initiële moleculaire signaal na insuline-interactie met zijn receptor (IR) is de activering van de intrinsieke tyrosine-eiwitkinaseactiviteit van IR2, resulterend in de autofosforylering3 en de daaropvolgende activering van een familie van eiwitten die bekend staat als insulinereceptorsubstraten (IRS), die bindt aan adaptoreiwitten die leiden tot activering van een cascade van eiwitkinasen4 . Insuline activeert twee belangrijke signaalroutes: fosfatidylinositol 3-kinase (PI3K)-eiwitkinase B (AKT) en Ras-mitogeen-geactiveerd eiwitkinase (MAPK). De eerste vormt een belangrijk vertakkingspunt of knooppunt 4,5 voor de activering van talrijke downstream-effectoren die betrokken zijn bij diverse fysiologische functies, waaronder de regulatie van brandstofhomeostase, terwijl de laatste de celgroei en differentiatie reguleert 4,6. Insuline acties zijn uiteindelijk afhankelijk van het celtype en de fysiologische context7.
Een van de belangrijkste insuline-responsieve metabole weefsels is het vetweefsel. Wit vetweefsel is het meest voorkomende type vet bij mensen en knaagdieren, verdeeld in onderhuids vet (tussen de huid en spieren) en visceraal vet (rond de organen in de buikholte). Gezien hun grote volume zijn adipocyten of vetcellen het meest voorkomende celtype in vetweefsel. Deze vetcellen kunnen bruin/beige (thermogeen), roze (in de borstklier) en wit 8,9 zijn. Witte adipocyten houden de belangrijkste energiereserves in het lichaam in de vorm van triglyceriden, een insulineafhankelijk proces. Insuline bevordert glucosetransport en lipogenese, terwijl het lipolyse of lipidenafbraak remt 7,10. Het vergemakkelijkt ook de differentiatie van preadipocyten in adipocyten – de volwassen vetopslagcellen11.
Insulineresistentie treedt op wanneer een normaal insulineniveau een verzwakte biologische respons produceert, wat resulteert in compenserende hyperinsulinemie12. Insulineresistentie is een aandoening geassocieerd met overgewicht en obesitas5, die in combinatie leidt tot diabetes type 2 (T2D) en andere stofwisselingsziekten13. Hyperinsulinemie compenseert insulineresistentie in perifere weefsels om normale bloedglucosespiegels te handhaven14. Uiteindelijk β-celverlies of -uitputting, samen met verergerde insulineresistentie, leidt echter tot verhoogde bloedglucosespiegels die consistent zijn met T2D5. Daarom kunnen insulineresistentie en hyperinsulinemie bijdragen aan de ontwikkeling van van obesitas afgeleide metabole ziekten15. Bovendien kan obesitas chronische laaggradige lokale ontsteking veroorzaken die insulineresistentie in vetweefsel bevordert15,16,17. Bovendien leiden van obesitas afgeleide veranderingen in vetweefsel, zoals fibrose, ontsteking en verminderde angiogenese en adipogenese, tot lagere adiponectine-serumspiegels (een insulinesensibilisator) en verhoogde secretie van factoren zoals plasminogeenactivatorremmer 1 (PAI-1), vrije vetzuren en exosomen in de bloedbaan, waardoor insulineresistentie wordt verergerd17.
Veel aspecten die ten grondslag liggen aan insulineresistentie blijven onbekend. In vitro en in vivo modellen zijn ontwikkeld om de mechanismen te bestuderen die insulineresistentie bemiddelen in belangrijke doelweefsels, waaronder vetweefsel. Het voordeel van in vitro modellen is dat onderzoekers meer controle hebben over de omgevingscondities en insulineresistentie in specifieke celtypen kunnen evalueren. Met name adipocytenvoorlopercellen (APC’s) hebben het individuele fenotype van het donorweefsel, dat de fysiologie beter kan weerspiegelen dan adipocytcellijnen. Een belangrijke factor die insulineresistentie in vitro induceert, is tumornecrosefactor-α (TNF-α). TNF-α is een pro-inflammatoir cytokine dat wordt uitgescheiden door adipocyten en macrofagen in vetweefsel18. Hoewel het nodig is voor een goede remodellering en expansie van vetweefsel19, induceert langdurige blootstelling aan TNF-α insulineresistentie in vetweefsel in vivo en in adipocyten in vitro20. Chronische TNF-α behandeling van verschillende celtypen leidt tot verhoogde serinefosforylering van zowel IR als IRS-1, waardoor verminderde tyrosinefosforylering wordt bevorderd21. Verhoogde fosforylering van IRS-1 op serineresiduen remt de IR-tyrosinekinaseactiviteit en kan een van de belangrijkste mechanismen zijn waardoor chronische TNF-α behandeling de insulinewerking schaadt22,23. TNF-α activeert routes waarbij de serine/threonine kinaseremmer van nucleaire factor ĸB kinase β (IKKβ) en c-Jun N terminal kinase (JNK)24 betrokken zijn. JNK induceert een complex pro-inflammatoir transcriptioneel programma, maar fosforyleert ook direct IRS-16.
Het begrijpen van de pathogenese van insulineresistentie is steeds belangrijker geworden om de ontwikkeling van toekomstige therapieën tegen T2D te begeleiden. APC’s hebben bewezen een uitstekend model te zijn voor de studie van vetcelbiologie, inclusief de gevoeligheid en resistentie tegen insuline, en voor het identificeren van de intrinsieke eigenschappen van adipocyten onafhankelijk van de systemische omgeving. APC’s kunnen gemakkelijk worden verkregen uit verschillende vetdepots en onder de juiste omstandigheden worden gedifferentieerd in volwassen adipocyten. Met deze methode kunnen directe effecten op insulineresistentie/gevoeligheid in adipocyten worden geëvalueerd.
Dit artikel biedt een methode voor het bestuderen van insulineresistentie die primaire adipocyten gebruikt in cultuur behandeld met TNF-α. Dit model heeft het voordeel dat primaire adipocyten gedurende lange tijd onder gedefinieerde omstandigheden kunnen worden gekweekt met een strakke controle van cellulaire omgevingsfactoren26. De testduur is 15-20 dagen, hoewel variaties in het percentage gedifferentieerde adipocyten kunnen optreden tussen experimenten. Primaire adipocyten hebben voordelen ten…
The authors have nothing to disclose.
We bedanken Daniel Mondragón, Antonio Prado, Fernando López-Barrera, Martín García-Servín, Alejandra Castilla en María Antonieta Carbajo voor hun technische assistentie, en Jessica Gonzalez Norris voor het kritisch bewerken van het manuscript. Dit protocol werd ondersteund door Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (CONACYT), Fondo Sectorial de Investigación para la Educación Grant 284771 (aan Y.M.).
1. Isolation mouse adipocyte precursor cells | |||
ACK lysing buffer | LONZA | 10-548E | |
Anti-Biotin Microbeads | Miltenyi | 130-090-485 | |
Anti-CD31 | eBioscience | 13-0311-85 | |
AutoMACS Pro Separator | Miltenyi | ||
Basement membrane matrix (matrigel) | Corning | 354234 | |
bFGF | Sigma | F0291 | Growth factor |
BSA | Equitech-Bio, Inc. | BAC63-1000 | |
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11) – Biotin | eBioscience | 13-0451-85 | |
Collagenase, Type 1 | Worthington Biochem | LS004197 | |
Dexamethasone | Sigma | D1756 | |
DMEM | GIBCO | 12800017 | |
DMEM low glucose | GIBCO | 31600-034 | |
EGF | Peprotech | 315-09 | Growth factor |
FBS | GIBCO | 26140-079 | |
ITS mix | Sigma | I3146 | |
L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | |
LIF | Millipore | ESG1107 | Growth factor |
Linoleic acid-albumin | Sigma | L9530 | |
MCDB 201 medium | Sigma | M6770 | |
Normocin | InvivoGen | ant-nr-2 | |
PDGF-BB | Peprotech | 315-18 | Growth factor |
Peniciline-Streptomycine | BioWest | L0022-100 | |
Pre-Separation Filters (70 µm) | Miltenyi | 130-095-823 | |
Purified Rat Anti-Mouse CD16 / CD32 | BD Pharmingen | 553142 | |
Trypsin-EDTA | GIBCO | 25300062 | |
2. Adipocyte differentiation and insulin resistance induction | |||
3-Isobutyl-1-methylxanthine [IBMX] | Sigma | I5879 | Differentiation cocktail |
BMP4 | R&D Systems | 5020-BP-010 | Differentiation cocktail |
Dexamethasone | Sigma | D1756 | Differentiation cocktail |
Insulin | Sigma | I9278 | |
Rosiglitazone | Cayman | 71742 | Differentiation cocktail |
TNFα | R&D Systems | 210-TA-005 | |
3. Evaluation of insulin signaling pathway by western blot | |||
Anti-beta tubulin antibody | Abcam | ab6046 | |
Bromophenol blue | BioRad | 161-0404 | Laemmli buffer |
EDTA | Sigma | E5134 | RIPA buffer |
EGTA | Sigma | E4378 | RIPA buffer |
FluorChem E system | ProteinSimple | ||
Glycerol | Sigma | G6279 | Laemmli buffer |
Glycine | Sigma | G7126 | Running and Transfer buffer |
Igepal | Sigma | I3021 | RIPA buffer |
2- mercaptoethanol | Sigma | M3148 | Laemmli buffer |
Methanol | JT Baker | 907007 | Transfer buffer |
NaCl | JT Baker | 3624-05 | TBS-T |
NaF | Sigma | 77F-0379 | RIPA buffer |
NaOH | JT Baker | 3722-19 | |
Na4P2O7 | Sigma | 114F-0762 | RIPA buffer |
Na3VO4 | Sigma | S6508 | RIPA buffer |
Nitrocellulose membrane | BioRad | 1620112 | |
Nonfat dry milk | BioRad | 1706404 | Blocking solution |
Prestained protein standard | BioRad | 1610395 | |
Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340-5ML | |
Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-035-132 | |
Phospho- Insulin Receptor β | Cell signaling | 3024 | |
Phospho-Akt (Ser473) Antibody | Cell signaling | 9271 | |
Phospho-IRS1 (Tyr608) antibody | Millipore | 9432 | |
Saccharose | JT Baker | 407205 | RIPA buffer |
SDS | BioRad | 1610302 | Running and laemmli buffer |
SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34577 | |
Tris-base | Promega | H5135 | Running, transfer and laemmli buffer |
Tris-HCl | JT Baker | 4103-02 | RIPA buffer – TBS |
Tween 20 | Sigma | P1379 | TBS-T |