Tarmmikrober, inklusive extracellulära bakterier och intracellulära patogener som Orsay-viruset och mikrosporidier (svampar), är ofta associerade med vilda Caenorhabditis-nematoder . Denna artikel presenterar ett protokoll för att upptäcka och kvantifiera mikrober som koloniserar och / eller infekterar C. elegans nematoder, och för att mäta patogenbelastning efter kontrollerade infektioner i laboratoriet.
Tarmarna hos vilda Caenorhabditis nematoder är bebodda av en mängd olika mikroorganismer, inklusive tarmmikrobiombakterier och patogener, såsom mikrosporidier och virus. På grund av likheterna mellan Caenorhabditis elegans och däggdjurs tarmceller, liksom kraften i C. elegans-systemet , har denna värd dykt upp som ett modellsystem för att studera värdtarm-mikrobinteraktioner in vivo. Även om det är möjligt att observera vissa aspekter av dessa interaktioner med ljusfältmikroskopi, är det svårt att exakt klassificera mikrober och karakterisera omfattningen av kolonisering eller infektion utan mer exakta verktyg. RNA-fluorescens in situ-hybridisering (FISH) kan användas som ett verktyg för att identifiera och visualisera mikrober i nematoder från naturen eller för att experimentellt karakterisera och kvantifiera infektion i nematoder infekterade med mikrober i labbet. FISH-sonder, som märker den mycket rikliga lilla subenheten ribosomalt RNA, ger en ljus signal för bakterier och mikrosporidceller. Prober som är utformade för att rikta in sig på bevarade regioner av ribosomalt RNA som är gemensamt för många arter kan detektera ett brett spektrum av mikrober, medan inriktning på divergerande regioner i ribosomalt RNA är användbart för smalare detektion. På samma sätt kan sonder utformas för att märka viralt RNA. Ett protokoll för RNA FISH-färgning med antingen paraformaldehyd (PFA) eller acetonfixering presenteras. PFA-fixering är idealisk för nematoder associerade med bakterier, mikrosporidier och virus, medan acetonfixering är nödvändig för visualisering av mikrosporidasporer. Djur tvättades först och fixerades i paraformaldehyd eller aceton. Efter fixering inkuberades FISH-sonder med prover för att möjliggöra hybridisering av sonder till det önskade målet. Djuren tvättades igen och undersöktes sedan på mikroskopglas eller med hjälp av automatiserade metoder. Sammantaget möjliggör detta FISH-protokoll detektion, identifiering och kvantifiering av mikroberna som bor i C. elegans-tarmen , inklusive mikrober för vilka det inte finns några genetiska verktyg tillgängliga.
Caenorhabditis elegans har vuxit fram som ett kraftfullt modellsystem för att studera medfödd immunitet och värd-mikrobinteraktioner i tarmepitelcellerna 1,2. På grund av att ha en transparent kropp och endast 20 tarmceller representerar C. elegans ett bekvämt system för övervakning av processerna för mikrobiell tarmkolonisering och infektion i samband med en intakt organism. Nematodtarmceller delar flera morfologiska och funktionella likheter med däggdjurs tarmepitelceller, vilket gör dem till en lätthanterlig in vivo-modell för dissektion av processer som styr mikrobiomkolonisering och patogeninfektion 3,4,5,6.
Vilda C. elegans matar på en mängd olika mikrober som koloniserar och infekterar tarmen, och provtagning av dessa nematoder har resulterat i upptäckten av virus, eukaryoter (svampar, oomycetes) och bakterier som naturligt associerar med denna värd 7,8,9,10. Orsay-viruset hittades infektera tarmen och är för närvarande det enda kända naturliga viruset av C. elegans9. Mikrosporidier är svamprelaterade obligatoriska intracellulära patogener som är den vanligaste infektionen vid vildfångad caenorhabdit, med flera arter som har upptäckts infektera C. elegans och besläktade nematoder 8,11. Många bakterier finns vanligtvis i tarmlumen hos vildfångade C. elegans och flera arter har etablerats som en naturlig modell för C. elegans mikrobiom (CeMbio)6,12,13,14. Att upptäcka och karakterisera mikrober som naturligt koloniserar och / eller infekterar C. elegans är viktigt för att förstå de genetiska mekanismerna som styr dessa värd-mikrobinteraktioner, samt visualisera nya mikrobiella processer som endast förekommer i samband med ett intakt värddjur.
Efter provtagning screenas vilda nematoder via differentiell interferenskontrast (DIC) mikroskopi för att leta efter fenotyper som indikerar infektion eller kolonisering. Till exempel kan förändringar i det stereotypa granulerade utseendet hos tarmcellerna associeras med närvaron av en intracellulär parasitinfektion8. Specifikt är förlusten av tarmgranuler och minskad cytosolisk viskositet tecken på virusinfektion, medan omorganisationen av tarmgranuler i “spår” kan indikera infektion med mikrosporidier i släktet Nematocida 8,9. Eftersom det finns en mängd olika mikrober närvarande i vilda C. elegans-prover kan det vara svårt att skilja mellan mikrober genom DIC-mikroskopi. Information om den rumsliga fördelningen av mikrober inom värden kan också vara svår att upptäcka på grund av den lilla storleken på många mikrober15. Dessutom är det inte alltid möjligt att odla vissa mikrober av intresse in vitro, vilket leder till svårigheter att upptäcka och/eller kvantifiera.
RNA-fluorescens in situ-hybridisering (FISH) tillhandahåller en metod för att fluorescerande märka mikrober genom att använda fluorescerande sonder som binder till RNA för den lilla ribosomala subenheten (SSU) i fasta celler. Om analys av morfologiska egenskaper tyder på en viss klass av mikrob, kan FISH-sonder som riktar sig mot specifika eller breda klasser av sådana mikrober användas. Till exempel anses EUB338 vara en universell sond för bakteriell SSU och används ofta för att detektera ett brett spektrum av bakterier16. Protokollet som beskrivs här använder enkelsträngade DNA-sonder som är slutmärkta med en fluorofor och speciellt utformade för att komplettera mål-SSU för mikroben av intresse, även om det finns tidigare utformade sonder tillgängliga16. Den största fördelen med att rikta in sig på SSU av mikrober är det relativt stora överflödet av detta RNA, som vanligtvis omfattar 80% -90% av allt RNA i cellen, vilket leder till färgning med ett mycket högt signal-brusförhållande17. Sonder kan också utformas för att rikta in sig på RNA för att upptäcka virus, som Orsay-viruset 9,18, som ofta finns i mycket höga kopior i infekterade celler om viruset aktivt replikerar.
Beroende på resultaten med kända sonder kan det vara nödvändigt att erhålla ytterligare sekvensinformation för att utforma mer specifika sonder för artbekräftelse in situ. Ett vanligt tillvägagångssätt är att använda universella primers mot bevarade regioner i SSU (16S för bakterier och 18S för eukaryoter) för att förstärka (via PCR) regioner som är mer divergerande8. Med hjälp av denna sekvensinformation kan sonder med mer artspecificitet utformas. Dessa FISH-sonder kan sedan möjliggöra identifiering av mikrober på ett kulturoberoende sätt8. Dessutom kan RNA FISH ge insikt i unika morfologiska koloniserings- och infektionsegenskaper, inklusive filamentation eller vävnadslokaliseringsmönster19,20. Olika färgade FISH-sonder kan användas samtidigt, vilket möjliggör visuell skillnad mellan mikrober i vilda nematodprover, samt observation av mikrob-mikrobdynamik inuti en värd15,20. Dessutom kan RNA FISH-färgning tillämpas på värd-patogeninteraktionsstudier där infektion och kolonisering av en känd art enkelt kan kvantifieras manuellt eller genom automatiserade metoder för att ge insikter om patogenbelastning, till exempel vid jämförelse av C. elegans-mutanter som antingen har ökat eller minskat resistens mot infektion21.
Vilda C. elegans är naturligt förknippade med en mängd olika mikrober. Forskare kan använda RNA FISH för att upptäcka och identifiera dessa mikrober samt få insikt i deras lokalisering i samband med ett helt djur. Mikrober med önskvärda eller intressanta fenotyper kan identifieras genom denna metod och sedan isoleras för ytterligare karakterisering och sekvensering. Överflödet av många bakterieisolat från vilda C. elegans kan också kvantifieras via RNA FISH29. Genom att använda protokollet som beskrivs här är det också möjligt att observera kända mikroorganismer inuti sina värdar och lära sig mer om deras interaktioner. Det är viktigt att Orsay-virus och mikrosporidier är obligatoriska parasiter och inte kan odlas oberoende av värden, så FISH är standardvisualiseringsverktyget. Kolonisering eller infektion kan också kvantifieras genom RNA FISH med hjälp av nematoder odlade på plattor sådda med en önskad odlingsbar bakterie av intresse. Förutom färgning av mikroorganismer i C. elegans tarm kan detta protokoll användas för andra nematodstammar som C. tropicalis eller Oscheius tipulae19,23.
Den största fördelen med FISH-protokollet är att det erbjuder en enkel, snabb och robust metod för att fläcka mikrober associerade med C. elegans. Bilder som produceras från FISH-färgning har ett högt signal-brusförhållande, vilket uppnås genom att använda FISH-sonder som riktar sig mot SSU: s rikliga RNA i provet. Eftersom det vanligtvis finns 30x eller högre nivåer av rRNA än rDNA, beror det mesta av signalen från FISH-färgning med sonder som riktar sig mot rRNA snarare än rDNA30. Dessutom gör RNA FISH det möjligt att se infektion eller kolonisering inom ramen för hela djuret. Denna visualisering underlättas genom samfärgning av värdkärnor med DAPI och / eller användning av fluorescerande märkta stammar av C. elegans för att bättre markera lokaliseringen av infektion eller kolonisering i provet. Till exempel användes mikrosporidspecifik FISH för att bestämma vävnadstropismen hos Nematocida displodere genom att använda en panel av C. elegans-stammar med GFP-uttryck i olika vävnader20. Dessutom är detta protokoll mottagligt för förändringar som gör det möjligt för forskare att bestämma de ideala förhållandena som är lämpliga för deras specifika behov (t.ex. justering av fixeringsperioden, ökning av hybridiseringstemperaturen).
Ett kritiskt steg i FISH-protokollet är att fixera proverna. Inkubationstiden efter tillsatsen av fixeringsmedlet är nödvändig för att ge medel tid att permeabilisera provet. Längre inkubationstider är inte idealiska för prover som innehåller transgena fluorescerande proteiner på grund av proteinnedbrytning av PFA över tid. För prover som innehåller GFP är det absolut nödvändigt att bestämma den optimala fixeringstiden för att möjliggöra permeabilisering, samtidigt som GFP-signalen bibehålls.
FISH kan användas för att färga för bakterier, virus eller mikrosporidier i C. elegans. Den bästa typen av fixeringsmedel som används för FISH beror dock på prov- och nedströmskraven. Detta protokoll presenterar en PFA-lösning som det primära fixeringsmedlet för att fläcka bakterier och virus. PFA är dock inte tillräckligt för visualisering av mikrosporidsporer eftersom det inte kan tränga igenom sporväggen. För visualisering av sporer bör aceton användas istället. Även om PFA-fixering är effektiv för FISH-märkning av andra livsstadier av mikrosporidier, inklusive sporoplasmer, meronter och sporonter. Andra stora skillnader ses mellan acetonfixering och PFA-fixering; Aceton är bekvämare eftersom prover snabbt kan förvaras i frysen efter tillsats utan att behöva tvättas. Aceton dödar dock snabbt all befintlig GFP i en transgen värd. PFA är det föredragna fixeringsmedlet om det är viktigt att bevara vissa fysiologiska strukturer i värden, eftersom acetonfixerade djur verkar vara mer försämrade, vilket gör det svårare att identifiera vissa vävnader. Eftersom proverna är fixerade tillåter detta FISH-protokoll inte levande avbildning av värd-mikrobinteraktioner in vivo. En pulsjaktinfektionstidskurs följt av FISH-färgning av prover vid olika tidpunkter kan dock göra det möjligt för en att se en viss dynamik av mikrobiell infektion 19,20,31.
Ett annat kritiskt steg i hela protokollet är noggrann tvättning av proverna före och efter hybridisering. Före hybridisering, när man samlar maskarna i mikrofugerören, kan överskott av bakterier eller andra mikrober från NGM-plattorna bäras med maskprovet. Tre tvättar med PBS-T är standard; emellertid kan fler tvättar vara nödvändiga för att tillräckligt eliminera externa mikroorganismer, särskilt vid användning av kraftigt förorenade, vildisolerade C. elegans. När du tittar på de monterade proverna efter FISH kan det finnas någon kvarvarande FISH-sond som producerar stora mängder signal i bakgrunden av provet. Tvätttemperaturen och antalet tvättar är viktiga för att ta bort överflödig och icke-specifikt bunden sond. För att minska bakgrundsfluorescensen är det möjligt att utföra två eller tre tvättar med 1 ml WB var 30: e minut, istället för en tvätt med 1 ml WB i en timme. Olika FISH-sonder kan kräva olika tvättemperaturer. Vanligtvis är tvätttemperaturen 2 °C över hybridiseringstemperaturen, men detta kan ökas om det finns för mycket bakgrundsfluorescens (högt brus).
FISH-protokollet använder fluorescerande sonder utformade för att rikta in sig på artspecifikt mikrobiellt RNA, men FISH-sonder kan utformas för andra transkript med hög kopia. Andra FISH-sonder kan ha olika smälttemperaturer, så inkubationssteg kan behöva utföras vid en högre eller lägre temperatur än beskrivet. FISH-färgning kan identifiera den rumsliga fördelningen av mikrobiell kolonisering eller infektion inom värden, vilket möjliggör karakterisering av värd-mikrob- och mikrob-mikrobinteraktioner. En begränsning är att endast ett fåtal konventionella fluoroforer kan användas samtidigt, vilket minskar antalet olika mikroorganismer som kan detekteras via FISH samtidigt. Detta begränsar dess användning för komplexa mikrobiomstudier i C. elegans. Flerfärgad rRNA-riktad FISH använder dock sonder märkta med icke-kanoniska fluoroforer som kan öka antalet distinkta mikrobiella gruppetiketter15. En annan begränsning är att det är svårt att skilja mellan närbesläktade arter, särskilt bakterier, som har SSU-sekvenser som är mycket lika. Den extrema sekvensdivergensen mellan mikrosporidiarter bidrar dock till att underlätta deras differentiering med detta protokoll (figur 3)32,33.
Sammantaget beskriver detta FISH-protokoll en teknik för att detektera mikroorganismer inom C. elegans. Det gör det möjligt för forskare att använda ett transparent och genetiskt lätthanterligt modellsystem för att upptäcka och kvantifiera kolonisering och infektion inom ramen för ett intakt djur, samt identifiera unikt mikrobiellt beteende eller morfologi inom värden. En förtryckt version av detta manuskript publicerades under granskning34.
The authors have nothing to disclose.
Tack till Dr. Marie-Anne Félix för att du förser oss med vilda nematodstammar. Detta arbete stöddes av NSF under CAREER Grant 2143718 och California State University under ett CSUPERB New Investigator Award till RJL, NIH under R01 AG052622 och R01 GM114139 till ERT, och av ett American Heart Association Fellowship till VL.
10% SDS | Invitrogen | AM9822 | |
Acetone | Fisher Scientific | A-11-1 | |
Antifade mounting serum with DAPI (Vectashield) | Vectalab | NC9524612 | |
EDTA | Fisher Scientific | S311-500 | |
FISH probes (see Table 1) | LGC Biosearch Technologies | FISH probes were commercially purchased via custom oligonucleotide synthesis | |
KCl | Fisher Scientific | P217 | |
KH2PO4 | Fisher Scientific | P-286 | |
Na2HPO4 | Fisher Scientific | S375-500 | |
NaCl | Fisher Scientific | S-671 | |
NH4Cl | Fisher Scientific | A-661 | |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 50-980-487 | CAUTION: PFA is a carcinogen. Handle appropriately |
Thermal mixer | Eppendorf | 5384000020 | |
Tris base | Fisher Scientific | BP152 | |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP-151 | |
Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 |