FACS-isolering och odling av fibro-adipogena förfäder och muskelstamceller från ostörd och skadad musskelettmuskel
Summary
Den exakta identifieringen av fibro-adipogenic stamceller (FAPs) och muskelstamceller (MuSC) är avgörande för att studera deras biologiska funktion under fysiologiska och patologiska tillstånd. Detta protokoll ger riktlinjer för isolering, rening och odling av FAPs och MuSC från vuxna musmuskler.
Abstract
Fibro-adipogenic stamceller (FAPs) är en population av skelettmuskelboende mesenkymala stromaceller (MSC) som kan differentieras längs fibrogen, adilogen, osteogen eller kondrogen härstamning. Tillsammans med muskelstamceller (MuSC) spelar FAPs en kritisk roll i muskelhomeostas, reparation och regenerering, samtidigt som de aktivt upprätthåller och omformar den extracellulära matrisen (ECM). Vid patologiska tillstånd, såsom kronisk skada och muskeldystrofier, genomgår FAPs avvikande aktivering och differentieras till kollagenproducerande fibroblaster och adipocyter, vilket leder till fibros och intramuskulär fettinfiltration. Således spelar FAPs en dubbel roll i muskelregenerering, antingen genom att upprätthålla MuSC-omsättningen och främja vävnadsreparation eller bidra till fibrotisk ärrbildning och ektopiska fettinfiltrat, vilket äventyrar skelettmuskelvävnadens integritet och funktion. En korrekt rening av FAP och MuSC är en förutsättning för att förstå dessa cellers biologiska roll i fysiologiska såväl som i patologiska tillstånd. Här beskriver vi en standardiserad metod för samtidig isolering av FAPs och MuSC från lemmuskler hos vuxna möss med hjälp av fluorescensaktiverad cellsortering (FACS). Protokollet beskriver i detalj den mekaniska och enzymatiska dissociationen av mononukleerade celler från hela extremitetsmuskler och skadade tibialis främre (TA) muskler. FAPs och MuSC isoleras därefter med hjälp av en halvautomatisk cellsorterare för att erhålla rena cellpopulationer. Vi beskriver dessutom en optimerad metod för odling av vilande och aktiverade FAPs och MuSCs, antingen ensamma eller i samodlingsförhållanden.
Introduction
Skelettmuskeln är den största vävnaden i kroppen, som står för ~ 40% av vuxen mänsklig vikt och ansvarar för att upprätthålla hållning, generera rörelse, reglera basal energimetabolism och kroppstemperatur1. Skelettmuskeln är en mycket dynamisk vävnad och har en anmärkningsvärd förmåga att anpassa sig till en mängd olika stimuli, såsom mekanisk stress, metaboliska förändringar och dagliga miljöfaktorer. Dessutom regenererar skelettmuskeln som svar på akut skada, vilket leder till fullständig återställning av dess morfologi och funktioner2. Skelettmuskelns plasticitet är huvudsakligen beroende av en population av bosatta muskelstamceller (MuSC), även kallade satellitceller, som ligger mellan myofiberplasmamembranet och basal lamina 2,3. Under normala förhållanden bor MuSC i muskelnischen i vilande tillstånd, med bara några få divisioner för att kompensera för cellulär omsättning och för att fylla på stamcellspoolen4. Som svar på skada går MuSC: er in i cellcykeln, sprider sig och bidrar antingen till bildandet av nya muskelfibrer eller återgår till nischen i en självförnyelseprocess 2,3. Förutom MuSC är homeostatiskt underhåll och regenerering av skelettmuskeln beroende av stöd från en population av muskelboende celler som heter fibro-adipogena förfäder (FAPs)5,6,7. FAPs är mesenkymala stromaceller inbäddade i muskelbindvävnaden och kan differentieras längs fibrogen, adipogen, osteogen eller kondrogen härstamning 5,8,9,10. FAPs ger strukturellt stöd för MuSC eftersom de är en källa till extracellulära matrisproteiner i muskelstamcellsnischen. FAPs främjar också långsiktigt underhåll av skelettmuskeln genom att utsöndra cytokiner och tillväxtfaktorer som ger trofiskt stöd för myogenes och muskeltillväxt 6,11. Vid akut muskelskada sprider sig FAPs snabbt för att producera en övergående nisch som stöder den regenererande muskelns strukturella integritet och ger en gynnsam miljö för att upprätthålla MuSCs spridning och differentiering på ett parakrint sätt5. När regenereringen fortskrider rensas FAPs från den regenerativa muskeln genom apoptos, och deras antal återgår gradvis till basalnivå12. Men under förhållanden som gynnar kronisk muskelskada åsidosätter FAPs pro-apoptotisk signalering och ackumuleras i muskelnischen, där de differentieras till kollagenproducerande fibroblaster och adipocyter, vilket leder till ektopiska fettinfiltrat och fibrotisk ärrbildning12,13.
På grund av deras multipotens och deras regenerativa förmågor har FAPs och MuSCs identifierats som potentiella mål inom regenerativ medicin för behandling av skelettmuskelsjukdomar. För att undersöka deras funktion och terapeutiska potential är det därför viktigt att upprätta effektiva och reproducerbara protokoll för isolering och odling av FAPs och MuSC.
Fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) kan identifiera olika cellpopulationer baserat på morfologiska egenskaper såsom storlek och granularitet och tillåter cellspecifik isolering baserat på användning av antikroppar riktade mot cellytmarkörer. Hos vuxna möss uttrycker MuSC den vaskulära celladhesionsmolekylen 1 (VCAM-1, även känd som CD106) 14,15 och α7-Integrin 15, medan FAP uttrycker den trombocyt-härledda tillväxtfaktorreceptorn α (PDGFRα) och stamcellsantigenet 1 (Sca1 eller Ly6A / E) 5,6,9,12,16,17 . I protokollet som beskrivs här identifierades MuSC:er som CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+, medan FAPs identifierades som CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-. Alternativt användes PDGFRαEGFP-möss för att isolera FAP som CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin- händelser18,19. Vidare jämförde vi överlappningen mellan den fluorescerande signalen från PDGFRα-GFP+-celler med celler som identifierats av ytmarkören Sca1. Vår analys visade att alla GFP-uttryckande celler också var positiva för Sca1, vilket indikerar att båda metoderna kan användas för identifiering och isolering av FAPs. Slutligen bekräftade färgning med specifika markörantikroppar renheten hos varje cellpopulation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Att upprätta effektiva och reproducerbara protokoll för identifiering och isolering av rena vuxna stamcellspopulationer är det första och mest kritiska steget mot att förstå deras funktion. Isolerade FAP och MuSC kan användas för att genomföra multiomikanalys i transplantationsexperiment som en potentiell behandling för muskelsjukdomar eller kan modifieras genetiskt för sjukdomsmodellering i stamcellsterapi.
Protokollet som beskrivs här ger standardiserade riktlinjer för identifi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Tom Cheung (Hong Kong University of Science & Technology) för råd om MuSC-isolering. Detta arbete finansierades av NIAMS-IRP genom NIH-bidrag AR041126 och AR041164.
Materials
| 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Falcon | 352063 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | Falcon | 352235 | |
| 20 G BD Needle 1 in. single use, sterile | BD Biosciences | 305175 | |
| anti-Alpha 7 Integrin PE (clone:R2F2) (RatIgG2b) | The University of British Columbia | 53-0010-01 | |
| APC anti-mouse CD31 Antibody | BioLegend | 102510 | |
| APC anti-mouse CD45 Antibody | BioLegend | 103112 | |
| BD FACSMelody Cell Sorter | BD Biosciences | ||
| BD Luer-Lok tip control syringe, 10-mL | BD Biosciences | 309604 | |
| Biotin anti-mouse CD106 Antibody | BioLegend | 105703 | |
| C57BL/6J mouse (Female and Male) | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J mouse | The Jackson Laboratory | 007669 | |
| Corning BioCoat Collagen I 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356400 | |
| Corning BioCoat Collagen I 12-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356500 | |
| Corning BioCoat Collagen I 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356408 | |
| DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile | VWR | 414004-265 | |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11055 | |
| Falcon 40 µm Cell Strainer, Blue, Sterile | Corning | 352340 | |
| Falcon 60 mm TC-treated Cell Culture Dish, Sterile | Corning | 353002 | |
| Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 15-mL | VWR | 352196 | |
| Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 50-mL | Corning | 352070 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes, Polypropylene, Corning | VWR | 60819-728 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes, Polystyrene, with 35um Cell Strainer Cap Corning | VWR | 21008-948 | |
| Fibroblast Growth Factor, Basic, Human, Recombinant (rhFGF, Basic) | Promega | G5071 | |
| FlowJo 10.8.1 | |||
| Gibco Collagenase, Type II, powder | ThermoFisher Scientific | 17101015 | |
| Gibco Dispase, powder | ThermoFisher Scientific | 17105041 | |
| Gibco DMEM, high glucose, HEPES | ThermoFisher Scientific | 12430054 | |
| Gibco Fetal Bovine Serum, certified, United States | ThermoFisher Scientific | 16000044 | |
| Gibco Ham's F-10 Nutrient Mix | ThermoFisher Scientific | 11550043 | |
| Gibco Horse Serum, New Zealand origin | ThermoFisher Scientific | 16050122 | |
| Gibco PBS, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Gibco PBS (10x), pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 70011044 | |
| Gibco Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | ThermoFisher Scientific | 10378016 | |
| Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A-21127 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools Inc | 14090-09 | |
| Invitrogen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D) | ThermoFisher Scientific | A1310 | |
| Mouse PDGF R alpha Antibody | R&D Systems | AF1062 | |
| Normal Donkey Serum | Fisher Scientific | NC9624464 | |
| Normal Goat Serum | ThermoFisher Scientific | 31872 | |
| Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca 1) Antibody | BioLegend | 108120 | |
| Paraformaldehyde, 16% | Fisher Scientific | NCC0528893 | |
| Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| PE/Cyanine7 Streptavidin | BioLegend | 405206 | |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools Inc | 91500-09 | |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools Inc | 91150-20 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
References
- Baskin, K. K., Winders, B. R., Olson, E. N. Muscle as a "mediator" of systemic metabolism. Cell Metabolism. 21 (2), 237-248 (2015).
- Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. Satellite cells and skeletal muscle regeneration. Comprehensive Physiology. 5 (3), 1027-1059 (2015).
- Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).
- Pawlikowski, B., Pulliam, C. J., Betta, N. D., Kardon, G., Olwin, B. B. Pervasive satellite cell contribution to uninjured adult muscle fibers. Skeletal Muscle. 5, 42 (2015).
- Joe, A. W. B., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).
- Wosczyna, M. N., et al. Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle. Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).
- Theret, M., Rossi, F. M. V., Contreras, O. Evolving roles of muscle-resident fibro-adipogenic progenitors in health, regeneration, neuromuscular disorders, and aging. Frontiers in Physiology. 12, 673404 (2021).
- Uezumi, A., Fukada, S. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).
- Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification. Journal of Bone and Mineral Research. 27 (5), 1004-1017 (2012).
- Eisner, C., et al. Murine tissue-resident PDGFRα+ fibro-adipogenic progenitors spontaneously acquire osteogenic phenotype in an altered inflammatory environment. Journal of Bone and Mineral Research. 35 (8), 1525-1534 (2020).
- Biferali, B., Proietti, D., Mozzetta, C., Madaro, L. Fibro-adipogenic progenitors cross-talk in skeletal muscle: The social network. Frontiers in Physiology. 10, 1074 (2019).
- Lemos, D. R., et al. Nilotinib reduces muscle fibrosis in chronic muscle injury by promoting TNF-mediated apoptosis of fibro/adipogenic progenitors. Nature Medicine. 21 (7), 786-794 (2015).
- Malecova, B., et al. Dynamics of cellular states of fibro-adipogenic progenitors during myogenesis and muscular dystrophy. Nature Communications. 9, 3670 (2018).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting. Skeletal Muscle. 8, 6-35 (2016).
- Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. Fibro/adipogenic progenitors (FAPs): Isolation by FACS and culture. Methods and Protocols. 1556, 179-189 (2017).
- Judson, R. N., Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. Isolation, culture, and differentiation of fibro/adipogenic progenitors (FAPs) from skeletal muscle. Methods in Molecular Biology. 1668, 93-103 (2017).
- Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).
- Contreras, O., et al. Cross-talk between TGF-β and PDGFRα signaling pathways regulates the fate of stromal fibro-adipogenic progenitors. Journal of Cell Science. 132 (19), (2019).
- Holmes, C., Stanford, W. L. Concise review: Stem cell antigen-1: Expression, function, and enigma. Stem Cells. 25 (6), 1339-1347 (2007).
- Rodgers, J. T., Schroeder, M. D., Chanthia, M., Rando, T. A. HGFA Is an injury-regulated systemic factor that induces the transition of stem cells into GAlert. Cell Reports. 19 (3), 479-486 (2017).
- García-Prat, L., et al. FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age. Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).
- Yamamoto, T., et al. Deterioration and variability of highly purified collagenase blends used in clinical islet isolation. Transplantation. 84 (8), 997-1002 (2007).
- Walls, P. L. L., et al. Quantifying the potential for bursting bubbles to damage suspended cells. Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).
- Kafadar, K. A., et al. Sca-1 expression is required for efficient remodeling of the extracellular matrix during skeletal muscle regeneration. Developmental Biology. 326 (1), 47-59 (2009).
