تسهيل الثقافة العضوية الدماغية من خلال إضاءة الضوء الناعم الجانبي
Summary
توفر المواد العضوية الدماغية فرصا غير مسبوقة لدراسة تطور الأعضاء وأمراض الأمراض البشرية. على الرغم من تحقيق نجاح كبير مع أنظمة الزراعة العضوية الدماغية ، إلا أنه لا تزال هناك صعوبات تشغيلية في تطبيق هذه التكنولوجيا. يصف هذا البروتوكول إجراء عضوي دماغي يسهل التغيير المتوسط والنقل العضوي.
Abstract
في الوقت الحاضر ، لا تزال تكنولوجيا الزراعة العضوية الدماغية معقدة للعمل ويصعب تطبيقها على نطاق واسع. من الضروري إيجاد حل بسيط وعملي. لذلك ، يقترح بروتوكول عضوي دماغي أكثر جدوى في هذه الدراسة. لحل الإزعاج الذي لا مفر منه في التغيير المتوسط ونقل العضوية في المرحلة المبكرة ، يعمل البحث الحالي على تحسين تقنية التشغيل من خلال تطبيق المبدأ الهندسي. تم اعتماد مصباح ضوئي ناعم لإلقاء الضوء أفقيا على عينات الجسم الجنيني (EB) ، مما يسمح برؤية EBs بالعين المجردة من خلال تأثير الانعكاس المنتشر المحسن. باستخدام مبدأ التدفق الثانوي الناتج عن الدوران ، تتجمع المواد العضوية نحو مركز البئر ، مما يسهل تشغيل التغيير المتوسط أو النقل العضوي. بالمقارنة مع الخلية المشتتة ، يستقر الجسم الجنيني بشكل أسرع في الماصة. باستخدام هذه الظاهرة ، يمكن إزالة معظم الخلايا الحرة وشظايا الخلايا الميتة بشكل فعال بطريقة بسيطة ، مما يمنع EBs من تكبد أضرار من الطرد المركزي. تسهل هذه الدراسة تشغيل الثقافة العضوية الدماغية وتساعد على تعزيز تطبيق المواد العضوية في الدماغ.
Introduction
بالمقارنة مع أنظمة الاستزراع ثنائية الأبعاد (2D) ، تتمتع أنظمة الاستزراع ثلاثية الأبعاد (3D) بالعديد من المزايا ، بما في ذلك التكرار الحقيقي والاستنساخ الفعال للهياكل المعقدة لبعض الأعضاء1. لذلك ، تعد المواد العضوية الدماغية واحدة من الطرق المساعدة المهمة لمجالات البحث في نمو الدماغ البشري والمرض2 ، وفحص الأدوية ، والعلاج الخلوي.
زراعة المواد العضوية الدماغية عن طريق طريقة التعليق الدوار تفضي إلى تطورها ونضجها3. على الرغم من أن أنظمة الزراعة العضوية الدماغية حققت نجاحا كبيرا ، إلا أنها لا تزال تواجه تحديات حرجة تحد من تطبيقها. على سبيل المثال ، تنطوي الزراعة اليدوية على خطوات معالجة معقدة وتضع عقبات أمام تحقيق تطبيقات واسعة النطاق. بالإضافة إلى ذلك ، في كل مرحلة من مراحل النمو في ثقافة المواد العضوية الدماغية ، هناك حاجة إلى تغييرات في وسائل الإعلام المختلفة والسيتوكينات4. ومع ذلك ، في المرحلة المبكرة ، يكون للعضويات أو EBs أحجام صغيرة (حوالي 200 ميكرومتر إلى 300 ميكرومتر) ولا يمكن الوصول إليها بصريا تقريبا بدون جهاز مناسب. حتما ، يتم مسح كمية معينة من العينات العضوية الثمينة بعيدا عند تغيير الوسط. تم استكشاف العديد من التقنيات للتغلب على هذا في أنواع أخرى من الثقافات العضوية ، وتشمل بعض الأمثلة غمر رقائق العضوية بأكملها في وسط ثقافة لمدة 3 أيام دون تدخل5 ؛ إضافة وسط جديد من خلال الغطاء بعد امتصاص الوسط القديم باستخدام ورق ماص5 ؛ أو تطبيق خطوط أنابيب الموائع الدقيقة المعقدة لتبادل السوائل6،7،8. عقبة أخرى تواجه في المرحلة المبكرة من زراعة المواد العضوية هي صعوبة تحقيق ملاحظات مباشرة بالعين المجردة ، والتي يمكن أن تسبب عمليات سيئة تؤدي إلى تلف عضوي وفقدانه أثناء خطوات نقل المواد العضوية. لذلك ، من الضروري إنشاء بروتوكول أكثر جدوى يسهل التغيير المتوسط ونقل المواد العضوية لتوليد المواد العضوية.
يتم اقتراح عملية محسنة مقابلة تستند إلى المبادئ الهندسية للتغلب على هذه المشاكل ، مما يسهل بشكل كبير ومريح العديد من الإجراءات العضوية. في الطبيعة ، عندما تشرق الشمس في منزل من خلال فجوة نافذة ، يمكن للعين المجردة رؤية الغبار يرقص في شعاع الضوء. بسبب الانعكاس المنتشر لأشعة الشمس على الغبار ، يتم انكسار بعض الضوء في مقلة العين لإنتاج صورة مرئية. مستوحاة من مبدأ هذه الظاهرة 9,10 ، صنعت هذه الدراسة مصباحا ضوئيا ناعما وأضاءت EBs أفقيا. وقد وجد أن EBs يمكن أن تكون واضحة بصريا دون التأثير على نطاق المشاهدة. يتم توليد تدفق ثانوي يشير إلى المركز في السائل عن طريق تدوير لوحة الثقافة بسبب تيارات الدوامة11. تتراكم EBs المنتشرة أصلا في وسط اللوحة. بناء على ذلك ، وظاهرة أن سرعة الترسيب للعضويات أسرع من سرعة الخلايا ، يتم اقتراح طريقة تشغيل سهلة للتغيير المتوسط ونقل المواد العضوية دون الطرد المركزي. يمكن فصل المواد العضوية في وسط المزرعة بشكل فعال عن الخلايا الحرة وشظايا الخلايا الميتة من خلال عملية النقل هذه.
هنا ، يتم اقتراح بروتوكول سهل التشغيل لتوليد عضويات دماغية من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات. تم تحسين تقنية التشغيل من خلال تطبيق المبدأ الهندسي ، مما يجعل العمليات في ثقافة 3D بسيطة ومجدية مثل تلك الموجودة في ثقافة 2D. طريقة تبادل السوائل المحسنة وعملية نقل العضوية مفيدة أيضا لأنواع أخرى من ثقافة العضوية وتصميم آلات الزراعة التلقائية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تفتح المواد العضوية الدماغية آفاقا جديدة للبحوث الطبية. العديد من التطبيقات المفيدة لهذه التكنولوجيا بدأت للتو في استكشافها28. وجد هذا البحث أن نتائج تسلسل النسخ للعضويات الدماغية المريضة وراثيا والمواد العضوية الدماغية الطبيعية يمكن أن تعكس الاختلافات بين المرض والصحة. عل?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذه الدراسة من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة قوانغدونغ (رقم المنحة 2020A0505100062) ، ومشروع الموضوعات الرئيسية للعلوم والتكنولوجيا في مدينة قوانغتشو (المنحة رقم 201904020025) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم المنحة 31872800 ، 32070582 ، 82101937) ، ومشروع منحة أبحاث ما بعد الدكتوراه في مدينة قوانغتشو (إلى بانغتشو تشن).
Materials
| 0.2 μm Filter | NEST Biotechnology, China | 331001 | |
| 1000 μL wide-bore pipette tip | Thermo Fisher Scientific, USA | 9405163 | |
| 200 μL wide-bore pipette tip | Thermo Fisher Scientific, USA | 9405020 | |
| 2-Mercaptoethanol | Merck, Germany | 8057400005 | |
| 4% Paraformaldehyde | Servicebio, China | G1101 | |
| 6-well low adhesion plate | NEST Biotechnology, China | 703011 | It is used for EBs suspension cultures |
| Aaccute cell detachment solution | STEMCELL Technologies, Canada | 07920 | It is used to digest iPSC into single cells. |
| AggreWell800 24-well | STEMCELL Technologies, Canada | 34811 | Microporous culture plate for EBs preparation. |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL Technologies, Canada | 07010 | Rinsing solution for cultureware to prevent cell adhesion |
| B27-vit. A supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 12587010 | |
| bFGF | Peprotech, USA | GMP100-18B | |
| BSA | Beyotime Biotechnology, China | ST025 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5810 R | It can be used for centrifugation of various types of centrifuge tubes, reagent bottles and working plates. |
| Cover glass | Shitai Laboratory Equipment, China | 10212020C | |
| DAPI | Beyotime Biotechnology, China | C1002 | Used for nuclear staining. After DAPI was combined with double stranded DNA, the maximum excitation wavelength was 364nm and the maximum emission wavelength was 454nm. |
| DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific, USA | 11330032 | |
| ES-quality FBS | Thermo Fisher Scientific, USA | 10270106 | |
| Ficoll Paque | General Electric Company, USA | 17-5442-02 | Isolate the peripheral blood mononuclear cells according to Ficoll-Paque method. |
| Gelatin | Sangon Bioteach, China | A609764 | |
| Glutamax supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 35050061 | |
| Glutamax supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 17504044 | |
| Goat anti-Chicken IgY secondary antibody | Abcam, UK | ab150171 | Goat anti-Chicken IgG. Conjugation: Alexa Fluor 647. Ex: 652 nm, Em: 668 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Goat anti-Mouse IgG secondary antibody | Abcam, UK | ab150120 | Goat anti-Mouse IgG. Conjugation: Alexa Fluor 594. Ex: 590 nm, Em: 617 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Goat anti-Rabbit IgG secondary antibody | Abcam, UK | ab150077 | Goat Anti-Rabbit IgG. Conjugation: Alexa Fluor 488. Ex: 495 nm, Em: 519 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Heparin | Merck, Germany | H3149 | |
| Horizontal shaker | Servicebio, China | DS-H200 | Relative centrifugal force (RCF) of 0.11808 x g is more appropriate, according to the manufacturer INFORS HT (Switzerland). |
| Insulin | Merck, Germany | I9278-5ML | |
| KOSR | Thermo Fisher Scientific, USA | 10828028 | |
| Matrigel | Corning, USA | 354277 | Matrigel will solidify in the environment higher than 4 °C, so it should be sub packed at low temperature. |
| MEM-NEAA | Thermo Fisher Scientific, USA | 11140050 | |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies, Canada | 85850 | iPSC culture medium |
| N2 supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 17502048 | |
| Neurobasal | Thermo Fisher Scientific, USA | 21103049 | |
| OCT4 primary antibody | Abcam, UK | ab19857 | Host: Rabbit. Dissolve with 500 μL PBS. Use at 1:200 dilution. |
| Pathological frozen slicer | Leica, Germany | Leica CM1860 | |
| PAX6 primary antibody | Abcam, UK | ab78545 | Host: Mouse. Use at 1:100 dilution. |
| PBS | STEMCELL Technologies, Canada | 37350 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, USA | 15140122 | |
| PSC dissociation solution | Beijing Saibei Biotechnology, China | CA3001500 | Enzyme free dissociation solution can be used for iPSC digestion and passage. |
| Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific, USA | A16518 | Establish iPSC according to the protocol of Sendai Reprogramming Kit. |
| Slide Glass | Shitai Laboratory Equipment, China | 188105W | |
| Soft light lamp | NUT | NUT | A simple self made device, refer to supplementary figure 2 for preparation. |
| STEMdiff Cerebral Organoid Kit | STEMCELL Technologies, Canada | 8570 | Contain: 1. EB Formation Medium; 2. Induction Medium; 3. Expansion Medium; 4. Maturation Medium. |
| STEMdiff Cerebral Organoid Maturation Kit | STEMCELL Technologies, Canada | 8571 | Maturation Medium |
| Sucrose | Sangon Bioteach, China | A502792 | |
| Triton X-100 | Merck, Germany | X100 | |
| TUJ1 primary antibody | Abcam, UK | ab41489 | Host: Chicken. Use at 1:1000 dilution. |
| Vaseline | Sangon Bioteach, China | A510146 | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies, Canada | 72302 | Prepare a 5 mM stock solution in PBS, resuspend 1 mg in 624 µL of PBS. |
| Weblink | |||
| Raw sequencing data | Genome Sequence Archive (Genomics, Proteomics & Bioinformatics 2021) in National Genomics Data Center (Nucleic Acids Res 2022), China National Center for Bioinformation / Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences | GSA-Human: HRA002430 | https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/ |
References
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7 (33), (2020).
- Quadrato, G., et al. Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids. Nature. 545 (7652), 48-53 (2017).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Qian, X., et al. et al.Brain-region-specific organoids using mini-bioreactors for modeling ZIKV exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Hu, Y., et al. Lung cancer organoids analyzed on microwell arrays predict drug responses of patients within a week. Nature Communications. 12 (1), 2581 (2021).
- Jung, D. J., et al. A one-stop microfluidic-based lung cancer organoid culture platform for testing drug sensitivity. Lab on a Chip. 19 (17), 2854-2865 (2019).
- Jalili-Firoozinezhad, S., et al. A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 520-531 (2019).
- Gkatzis, K., Taghizadeh, S., Huh, D., Stainier, D. Use of three-dimensional organoids and lung-on-a-chip methods to study lung development, regeneration and disease. The European Respiratory Journal. 52 (5), 1800876 (2018).
- Ye, Y., Pui, D. Detection of nanoparticles suspended in a light scattering medium. Scientific Reports. 11 (1), 20268 (2021).
- Staven, V., Waaseth, M., Wang, S., Grønlie, I., Tho, I. Utilization of the tyndall effect for enhanced visual detection of particles in compatibility testing of intravenous fluids: Validity and reliability. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology. 69 (2), 270-283 (2015).
- Fukuma, Y., Inui, T., Imashiro, C., Kurashina, Y., Takemura, K. Homogenization of initial cell distribution by secondary flow of medium improves cell culture efficiency. PloS One. 15 (7), 0235827 (2020).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Ouyang, S., et al. CRISPR/Cas9-targeted deletion of polyglutamine in spinocerebellar ataxia type 3-derived induced pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 27 (11), 756-770 (2018).
- Xian, Y., et al. The safety and effectiveness of genetically corrected iPSCs derived from β-thalassaemia patients in nonmyeloablative β-thalassaemic mice. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 288 (2020).
- Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Current Protocols in Immunology. , (2001).
- Knight, G. T., et al. Engineering induction of singular neural rosette emergence within hPSC-derived tissues. eLife. 7, 37549 (2018).
- Rieder, H. L., Smithwick, R. W. RPM or RCF. The American Review of Respiratory Disease. 132 (6), 1371 (1985).
- Dole, V. P., Cotzias, G. C. A nomogram for the calculation of relative centrifugal force. Science. 113 (2941), 552-553 (1951).
- Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).
- Jacob, F., et al. Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium. Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).
- Kathuria, A., et al. Transcriptomic landscape and functional characterization of induced pluripotent stem cell-derived cerebral organoids in schizophrenia. JAMA Psychiatry. 77 (7), 745-754 (2020).
- Paşca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nature Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
- Hu, B. Y., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4335-4340 (2010).
- Tang, X. Y., et al. DSCAM/PAK1 pathway suppression reverses neurogenesis deficits in iPSC-derived cerebral organoids from patients with Down syndrome. The Journal of Clinical Investigation. 131 (12), 135763 (2021).
- Costa, M., Paulson, H. L. Toward understanding Machado-Joseph disease. Progress in Neurobiology. 97 (2), 239-257 (2012).
- Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nature Biotechnology. 28 (5), 511-515 (2010).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Klockgether, T., et al. Age related axonal neuropathy in spinocerebellar ataxia type 3/Machado-Joseph disease (SCA3/MJD). Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 66 (2), 222-224 (1999).
- Khan, L. A., et al. Expanded polyglutamines impair synaptic transmission and ubiquitin-proteasome system in Caenorhabditis elegans. Journal of Neurochemistry. 98 (2), 576-587 (2006).
- Teixeira-Castro, A., et al. Serotonergic signalling suppresses ataxin 3 aggregation and neurotoxicity in animal models of Machado-Joseph disease. Brain: A Journal of Neurology. 138, 3221-3237 (2015).
- Joers, J. M., et al. Neurochemical abnormalities in premanifest and early spinocerebellar ataxias. Annals of Neurology. 83 (4), 816-829 (2018).
- Sivitilli, A., Ghiasi, P., Attisano, L. Production of phenotypically uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Bio-protocol. 11 (8), 3985 (2021).
- Sivitilli, A. A., et al. Robust production of uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Life Science Alliance. 3 (5), (2020).
- Camp, J. G., Treutlein, B. Human development: Advances in mini-brain technology. Nature. 545 (7652), 39-40 (2017).
- Giandomenico, S. L., Sutcliffe, M., Lancaster, M. A. Generation and long-term culture of advanced cerebral organoids for studying later stages of neural development. Nature Protocols. 16 (2), 579-602 (2021).
- Yoon, S. J., et al. Reliability of human cortical organoid generation. Nature Methods. 16 (1), 75-78 (2019).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).
