측면 소프트 라이트 조명을 통한 대뇌 오가노이드 문화 촉진
1Department of Obstetrics and Gynecology, Guangdong Provincial Key Laboratory of Major Obstetric Diseases,The Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, 2Key Laboratory of Reproduction and Genetics of Guangdong Higher Education Institutes, 3School of Biotechnology and Health Sciences,Wuyi University
Summary
대뇌 오가노이드는 장기 발달 및 인간 질병 병리학을 연구하기위한 전례없는 기회를 제공합니다. 대뇌 오가노이드 배양 시스템으로 큰 성공을 거두었지만이 기술을 적용하는 데는 여전히 운영상의 어려움이 있습니다. 본 프로토콜은 중간 변화 및 오가노이드 전달을 용이하게 하는 대뇌 오가노이드 절차를 기술한다.
Abstract
현재 대뇌 오가노이드 배양 기술은 여전히 운영이 복잡하고 대규모로 적용하기가 어렵습니다. 간단하고 실용적인 해결책을 찾아야합니다. 따라서, 본 연구에서 보다 실현 가능한 대뇌 오가노이드 프로토콜이 제안된다. 초기 단계에서 중간 변화 및 오가노이드 전달의 피할 수없는 불편 함을 해결하기 위해 현재 연구는 엔지니어링 원칙을 적용하여 운영 기술을 최적화합니다. 배아체(EB) 샘플을 측면으로 비추기 위해 소프트 라이트 램프를 채택하여 EB를 향상된 확산 반사 효과를 통해 육안으로 볼 수 있도록 했습니다. 회전에 의해 생성 된 이차 흐름의 원리를 사용하여, 오가노이드는 우물의 중심을 향해 모여 중간 변화 또는 오가노이드 전달의 작동을 용이하게합니다. 분산 된 세포와 비교할 때, 배아체는 피펫에서 더 빨리 정착합니다. 이 현상을 사용하면 대부분의 자유 세포 및 죽은 세포 단편을 간단한 방법으로 효과적으로 제거 할 수있어 EB가 원심분리로 인한 손상을 입지 않도록합니다. 이 연구는 대뇌 오가노이드 문화의 작동을 용이하게하고 뇌 오가노이드의 적용을 촉진하는 데 도움이됩니다.
Introduction
2차원(2D) 배양 시스템과 비교하여, 3차원(3D) 배양 시스템은 특정 장기의 복잡한 구조의 진정한 복제 및 효율적인 재생을 포함하여 몇 가지 장점을 갖는다1. 따라서 대뇌 오가노이드는 인간 뇌 발달 및 질병2, 약물 스크리닝 및 세포 치료의 연구 분야에서 중요한 보조 방법 중 하나입니다.
회전 현탁액 방법에 의해 대뇌 오가노이드를 배양하는 것은 그들의 발달과 성숙에 도움이됩니다3. 대뇌 오가노이드 배양 시스템은 큰 성공을 거두었지만 여전히 적용을 제한하는 중대한 도전에 직면 해 있습니다. 예를 들어, 수동 재배는 복잡한 조작 단계를 포함하며 대규모 응용 프로그램을 달성하는 데 장애물을 초래합니다. 또한, 대뇌 오가노이드 배양의 각 발달 단계에서, 상이한 배지 및 사이토카인의 변화가 필요하다4. 그러나 초기 단계에서 오가노이드 또는 EB는 작은 크기 (약 200 μm ~ 300 μm)를 가지며 적절한 장치 없이는 거의 시각적으로 접근 할 수 없습니다. 필연적으로, 일정량의 귀중한 오가노이드 샘플은 배지가 변경될 때 플러시됩니다. 다른 종류의 오가노이드 배양에서 이것을 극복하기 위해 많은 기술이 탐구되었으며, 일부 예에는 개입없이 3 일 동안 전체 오가노이드 칩을 배양 배지에 침지하는 것이 포함됩니다5; 오래된 배지가 흡수성 종이를 사용하여 흡수된 후에 커버슬립을 통해 신선한 배지를 첨가하는단계(5); 또는 유체 교환을 위해 복잡한 미세 유체 파이프 라인을 적용 6,7,8. 오가노이드 재배의 초기 단계에서 직면 한 또 다른 장애물은 육안으로 직접 관찰을 달성하기가 어렵 기 때문에 오가노이드 전달 단계 중에 오가노이드 손상 및 손실을 초래하는 불량한 작동을 유발할 수 있습니다. 따라서, 오가노이드를 생성하기 위해 중간 변화 및 오가노이드 전달을 용이하게하는보다 실현 가능한 프로토콜을 수립 할 필요가있다.
이러한 문제를 극복하기 위해 엔지니어링 원칙에 기반한 해당 최적화 된 작업이 제안되어 많은 오가노이드 절차가 상당히 편리하게 용이합니다. 자연에서 태양이 창문 틈을 통해 집에 비추면 육안으로는 광선에서 춤추는 먼지를 볼 수 있습니다. 먼지에 햇빛이 확산되어 반사되기 때문에 일부 빛은 안구로 굴절되어 시각적 이미지를 생성합니다. 이 현상 9,10의 원리에서 영감을 얻은 이 연구는 부드러운 조명 램프를 만들고 EB를 옆으로 비췄습니다. EB는 시야 범위에 영향을 미치지 않고 시각적으로 명확 할 수 있음을 발견했습니다. 중심을 가리키는 이차 흐름은 와류(11)로 인해 배양 플레이트를 회전시킴으로써 액체에서 생성된다. 원래 분산된 EB는 플레이트의 중앙에 축적됩니다. 이를 바탕으로, 오가노이드의 침강 속도가 세포의 침강 속도보다 빠르다는 현상이 있으며, 원심분리 없이 배지 변경 및 오가노이드 이송이 용이한 조작방법이 제안된다. 배양 배지 내의 오가노이드는 이러한 전달 조작을 통해 자유 세포 및 죽은 세포 단편으로부터 효과적으로 분리될 수 있다.
여기서, 조작하기 쉬운 프로토콜이 인간 다능성 줄기 세포로부터 대뇌 오가노이드를 생성하도록 제안된다. 운영 기술은 엔지니어링 원리를 적용하여 최적화되었으며, 3D 문화에서의 작업을 2D 문화에서처럼 간단하고 실현 가능하게 만들었습니다. 향상된 액체 교환 방법 및 오가노이드 전달 작동은 다른 유형의 오가노이드 배양 및 자동 배양 기계 설계에도 도움이됩니다.
Protocol
이 프로토콜은 헬싱키 선언에 따라 수행되었습니다. 광저우 의과 대학 세 번째 부속 병원 윤리위원회 (의료 및 윤리 검토 [2021] No. 022)의 승인이 부여되었습니다. 실험 전에, 각 배지는 Juergen A. Knoblich사의 화학식12 (보충 표 1-4)에 따라 제조되거나, 시판되는 대뇌 오가노이드 키트를 사용하였다 ( 표 참조). 이 연구에 사용 된 iPSC는 이전에 우리 실험실에서 ?…
Representative Results
본 연구는 iPSCs(도 2B)를 대뇌 오가노이드로 유도하였다(도 2C). 초기 단계에서 재배된 EB는 OCT4 마커(그림 2A)를 나타내었으며, 이는 양호한 다능성을 나타냈다. 후기 단계에서 EB는 성숙한 대뇌 오가노이드로 발전했습니다 (그림 2D). 이 연구는 정상적인 건강한 개인과 SCA3 환자의 iPSC를 대뇌 오가노이드로 배양?…
Discussion
대뇌 오가노이드는 의학 연구를위한 새로운 길을 열어줍니다. 이 기술의 많은 유용한 응용은 단지 탐구되기 시작했다28. 이 연구는 유전적으로 병든 대뇌 오가노이드와 정상 뇌 오가노이드의 전사체 시퀀싱 결과가 질병과 건강의 차이를 반영할 수 있음을 발견했다. 예를 들어, RNA-seq 데이터 분석 결과(도 3B)는 SCA3 질환 29,30,31,32에 대한 많은 보고된 연구와 일치<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 광동성 자연 과학 재단 (보조금 번호 2020A0505100062), 광저우시 과학 기술 핵심 주제 프로젝트 (보조금 번호 201904020025), 중국 국립 자연 과학 재단 (보조금 번호 31872800, 32070582, 82101937), 광저우시 박사후 연구 보조금 프로젝트 (Bangzhu Chen)의 지원을 받았다.
Materials
| 0.2 μm Filter | NEST Biotechnology, China | 331001 | |
| 1000 μL wide-bore pipette tip | Thermo Fisher Scientific, USA | 9405163 | |
| 200 μL wide-bore pipette tip | Thermo Fisher Scientific, USA | 9405020 | |
| 2-Mercaptoethanol | Merck, Germany | 8057400005 | |
| 4% Paraformaldehyde | Servicebio, China | G1101 | |
| 6-well low adhesion plate | NEST Biotechnology, China | 703011 | It is used for EBs suspension cultures |
| Aaccute cell detachment solution | STEMCELL Technologies, Canada | 07920 | It is used to digest iPSC into single cells. |
| AggreWell800 24-well | STEMCELL Technologies, Canada | 34811 | Microporous culture plate for EBs preparation. |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL Technologies, Canada | 07010 | Rinsing solution for cultureware to prevent cell adhesion |
| B27-vit. A supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 12587010 | |
| bFGF | Peprotech, USA | GMP100-18B | |
| BSA | Beyotime Biotechnology, China | ST025 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5810 R | It can be used for centrifugation of various types of centrifuge tubes, reagent bottles and working plates. |
| Cover glass | Shitai Laboratory Equipment, China | 10212020C | |
| DAPI | Beyotime Biotechnology, China | C1002 | Used for nuclear staining. After DAPI was combined with double stranded DNA, the maximum excitation wavelength was 364nm and the maximum emission wavelength was 454nm. |
| DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific, USA | 11330032 | |
| ES-quality FBS | Thermo Fisher Scientific, USA | 10270106 | |
| Ficoll Paque | General Electric Company, USA | 17-5442-02 | Isolate the peripheral blood mononuclear cells according to Ficoll-Paque method. |
| Gelatin | Sangon Bioteach, China | A609764 | |
| Glutamax supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 35050061 | |
| Glutamax supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 17504044 | |
| Goat anti-Chicken IgY secondary antibody | Abcam, UK | ab150171 | Goat anti-Chicken IgG. Conjugation: Alexa Fluor 647. Ex: 652 nm, Em: 668 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Goat anti-Mouse IgG secondary antibody | Abcam, UK | ab150120 | Goat anti-Mouse IgG. Conjugation: Alexa Fluor 594. Ex: 590 nm, Em: 617 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Goat anti-Rabbit IgG secondary antibody | Abcam, UK | ab150077 | Goat Anti-Rabbit IgG. Conjugation: Alexa Fluor 488. Ex: 495 nm, Em: 519 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Heparin | Merck, Germany | H3149 | |
| Horizontal shaker | Servicebio, China | DS-H200 | Relative centrifugal force (RCF) of 0.11808 x g is more appropriate, according to the manufacturer INFORS HT (Switzerland). |
| Insulin | Merck, Germany | I9278-5ML | |
| KOSR | Thermo Fisher Scientific, USA | 10828028 | |
| Matrigel | Corning, USA | 354277 | Matrigel will solidify in the environment higher than 4 °C, so it should be sub packed at low temperature. |
| MEM-NEAA | Thermo Fisher Scientific, USA | 11140050 | |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies, Canada | 85850 | iPSC culture medium |
| N2 supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 17502048 | |
| Neurobasal | Thermo Fisher Scientific, USA | 21103049 | |
| OCT4 primary antibody | Abcam, UK | ab19857 | Host: Rabbit. Dissolve with 500 μL PBS. Use at 1:200 dilution. |
| Pathological frozen slicer | Leica, Germany | Leica CM1860 | |
| PAX6 primary antibody | Abcam, UK | ab78545 | Host: Mouse. Use at 1:100 dilution. |
| PBS | STEMCELL Technologies, Canada | 37350 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, USA | 15140122 | |
| PSC dissociation solution | Beijing Saibei Biotechnology, China | CA3001500 | Enzyme free dissociation solution can be used for iPSC digestion and passage. |
| Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific, USA | A16518 | Establish iPSC according to the protocol of Sendai Reprogramming Kit. |
| Slide Glass | Shitai Laboratory Equipment, China | 188105W | |
| Soft light lamp | NUT | NUT | A simple self made device, refer to supplementary figure 2 for preparation. |
| STEMdiff Cerebral Organoid Kit | STEMCELL Technologies, Canada | 8570 | Contain: 1. EB Formation Medium; 2. Induction Medium; 3. Expansion Medium; 4. Maturation Medium. |
| STEMdiff Cerebral Organoid Maturation Kit | STEMCELL Technologies, Canada | 8571 | Maturation Medium |
| Sucrose | Sangon Bioteach, China | A502792 | |
| Triton X-100 | Merck, Germany | X100 | |
| TUJ1 primary antibody | Abcam, UK | ab41489 | Host: Chicken. Use at 1:1000 dilution. |
| Vaseline | Sangon Bioteach, China | A510146 | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies, Canada | 72302 | Prepare a 5 mM stock solution in PBS, resuspend 1 mg in 624 µL of PBS. |
| Weblink | |||
| Raw sequencing data | Genome Sequence Archive (Genomics, Proteomics & Bioinformatics 2021) in National Genomics Data Center (Nucleic Acids Res 2022), China National Center for Bioinformation / Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences | GSA-Human: HRA002430 | https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/ |
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Cite This Article
Chen, B., Lin, Q., Liu, N., Chen, D., Zhang, Y., Sun, X. Facilitating Cerebral Organoid Culture via Lateral Soft Light Illumination. J. Vis. Exp. (184), e63989, doi:10.3791/63989 (2022).