Facilitering af cerebral organoidkultur via lateral blød lysbelysning

Summary

Cerebrale organoider giver hidtil usete muligheder for at studere organudvikling og human sygdomspatologi. Selvom der er opnået stor succes med cerebrale organoidkultursystemer, er der stadig operationelle vanskeligheder med at anvende denne teknologi. Den nuværende protokol beskriver en cerebral organoid procedure, der letter medium forandring og organoid overførsel.

Abstract

På nuværende tidspunkt er cerebral organoidkulturteknologi stadig kompliceret at betjene og vanskelig at anvende i stor skala. Det er nødvendigt at finde en enkel og praktisk løsning. Derfor foreslås en mere gennemførlig cerebral organoidprotokol i denne undersøgelse. For at løse de uundgåelige ulemper ved medium ændring og organoidoverførsel i den tidlige fase optimerer den nuværende forskning driftsteknologien ved at anvende ingeniørprincippet. En blød lyslampe blev vedtaget til sideværts at belyse embryoidlegemet (EB) prøver, så EB’erne kunne ses med det blotte øje gennem den forbedrede diffuse refleksionseffekt. Ved hjælp af princippet om sekundær strømning genereret ved rotation samles organoiderne mod midten af brønden, hvilket letter driften af medium ændring eller organoidoverførsel. Sammenlignet med den dispergerede celle sætter den embryoide krop sig hurtigere i pipetten. Ved hjælp af dette fænomen kan de fleste af de frie celler og døde cellefragmenter fjernes effektivt på en enkel måde, hvilket forhindrer EB’er i at pådrage sig skader fra centrifugering. Denne undersøgelse letter driften af cerebral organoidkultur og hjælper med at fremme anvendelsen af hjerneorganoider.

Introduction

Sammenlignet med todimensionale (2D) kultursystemer har tredimensionelle (3D) kultursystemer flere fordele, herunder ægte replikation og effektiv reproduktion af komplekse strukturer af visse organer¹. Derfor er cerebrale organoider en af de vigtige hjælpemetoder til forskningsområderne for menneskelig hjerneudvikling og sygdom², lægemiddelscreening og celleterapi.

Dyrkning af cerebrale organoider ved den roterende suspensionsmetode er befordrende for deres udvikling og modning³. Selvom cerebrale organoidkultursystemer har opnået stor succes, står de stadig over for kritiske udfordringer, der begrænser deres anvendelse. For eksempel involverer manuel dyrkning komplicerede manipulationstrin og introducerer hindringer for at opnå store applikationer. Derudover er der på hvert udviklingsstadium i kulturen af cerebrale organoider behov for ændringer i forskellige medier og cytokiner⁴. I det tidlige stadium har organoiderne eller EB’erne imidlertid små størrelser (ca. 200 μm til 300 μm) og er næsten visuelt utilgængelige uden passende apparater. Uundgåeligt skylles en vis mængde dyrebare organoidprøver væk, når mediet ændres. Mange teknikker er blevet udforsket for at overvinde dette i andre former for organoidkulturer, og nogle eksempler inkluderer nedsænkning af hele organoidchips i et kulturmedium i 3 dage uden intervention⁵; tilsætning af et friskt medium gennem dækslippen, efter at det gamle medium er absorberet ved hjælp af absorberende papir⁵; eller anvendelse af komplekse mikrofluidiske rørledninger til væskeudveksling ^6,7,8. En anden hindring, der opstår i den tidlige fase af organoiddyrkning, er vanskeligheden ved at opnå direkte observationer med det blotte øje, hvilket kan forårsage dårlige operationer, der fører til organoidskade og tab under organoidoverførselstrinnene. Derfor er det nødvendigt at etablere en mere gennemførlig protokol, der letter medium forandring og organoidoverførsel for at generere organoider.

En tilsvarende optimeret drift baseret på tekniske principper foreslås for at overvinde disse problemer, hvilket betydeligt og bekvemt letter mange organoidprocedurer. I naturen, når solen skinner ind i et hus gennem et vindueshul, kan det blotte øje se støvet danse i lysstrålen. På grund af den diffuse refleksion af sollys på støv brydes noget lys ind i øjeæblet for at producere et visuelt billede. Inspireret af princippet om dette fænomen ^9,10 lavede denne undersøgelse en blød lyslampe og oplyste EB’erne sideværts. Det blev konstateret, at EB’er kunne være visuelt klare uden at påvirke visningsomfanget. En sekundær strømning, der peger mod midten, genereres i væsken ved at dreje kulturpladen på grund af hvirvelstrømme¹¹. Oprindeligt spredte EB’er akkumuleres i midten af pladen. Baseret på dette og det fænomen, at organoidernes sedimentationshastighed er hurtigere end cellernes, foreslås en nem driftsmetode til mediumændring og organoidoverførsel uden centrifugering. Organoiderne i kulturmediet kan effektivt adskilles fra frie celler og døde cellefragmenter gennem denne overførselsoperation.

Her foreslås en protokol, der er let at betjene, for at generere cerebrale organoider fra humane pluripotente stamceller. Driftsteknologien blev optimeret ved at anvende ingeniørprincippet, hvilket gjorde operationer i 3D-kultur så enkle og gennemførlige som dem i 2D-kultur. Den forbedrede væskeudvekslingsmetode og organoidoverførselsoperation er også nyttige til andre typer organoidkultur og design af automatiske kulturmaskiner.

Protocol

Protokollen blev gennemført efter Helsingfors-erklæringen. Godkendelse blev givet af den etiske komité for det tredje tilknyttede hospital i Guangzhou Medical University (medicinsk og etisk gennemgang [2021] nr. 022). Før eksperimentet blev hvert medium fremstillet i henhold til Juergen A. Knoblichs formel12 (supplerende tabeller 1-4), eller der blev anvendt et kommercielt tilgængeligt cerebralt organoidsæt (se materialetabel). De iPSC’er, der anvendes i den…

Representative Results

Den foreliggende undersøgelse inducerede iPSC’er (figur 2B) i cerebrale organoider (figur 2C). De EB’er, der blev dyrket i den tidlige fase, udtrykte OCT4-markøren (figur 2A), som indikerede god pluripotens. I den senere fase udviklede EB’erne sig til modne cerebrale organoider (figur 2D). Forskningen dyrkede iPSC’er fra normale raske individer og SCA3-patienter til cerebrale organoider (<strong class…

Discussion

Cerebrale organoider åbner nye veje til medicinsk forskning. Mange nyttige anvendelser af denne teknologi er kun begyndt at blive udforsket²⁸. Denne forskning viste, at transkriptomsekventeringsresultaterne af genetisk syge cerebrale organoider og normale cerebrale organoider kan afspejle forskellene mellem sygdom og sundhed. For eksempel er RNA-seq-dataanalyseresultaterne (figur 3B) i overensstemmelse med mange rapporterede undersøgelser af SCA3-sygdomme 29,30,31,3…

Materials

0.2 μm Filter	NEST Biotechnology, China	331001
1000 μL wide-bore pipette tip	Thermo Fisher Scientific, USA	9405163
200 μL wide-bore pipette tip	Thermo Fisher Scientific, USA	9405020
2-Mercaptoethanol	Merck, Germany	8057400005
4% Paraformaldehyde	Servicebio, China	G1101
6-well low adhesion plate	NEST Biotechnology, China	703011	It is used for EBs suspension cultures
Aaccute cell detachment solution	STEMCELL Technologies, Canada	07920	It is used to digest iPSC into single cells.
AggreWell800 24-well	STEMCELL Technologies, Canada	34811	Microporous culture plate for EBs preparation.
Anti-Adherence Rinsing Solution	STEMCELL Technologies, Canada	07010	Rinsing solution for cultureware to prevent cell adhesion
B27-vit. A supplement	Thermo Fisher Scientific, USA	12587010
bFGF	Peprotech, USA	GMP100-18B
BSA	Beyotime Biotechnology, China	ST025
Centrifuge	Eppendorf, Germany	5810 R	It can be used for centrifugation of various types of centrifuge tubes, reagent bottles and working plates.
Cover glass	Shitai Laboratory Equipment, China	10212020C
DAPI	Beyotime Biotechnology, China	C1002	Used for nuclear staining. After DAPI was combined with double stranded DNA, the maximum excitation wavelength was 364nm and the maximum emission wavelength was 454nm.
DMEM-F12	Thermo Fisher Scientific, USA	11330032
ES-quality FBS	Thermo Fisher Scientific, USA	10270106
Ficoll Paque	General Electric Company, USA	17-5442-02	Isolate the peripheral blood mononuclear cells according to Ficoll-Paque method.
Gelatin	Sangon Bioteach, China	A609764
Glutamax supplement	Thermo Fisher Scientific, USA	35050061
Glutamax supplement	Thermo Fisher Scientific, USA	17504044
Goat anti-Chicken IgY  secondary antibody	Abcam, UK	ab150171	Goat anti-Chicken IgG. Conjugation: Alexa Fluor 647. Ex: 652 nm, Em: 668 nm. Use at 1:500 dilution.
Goat anti-Mouse IgG secondary antibody	Abcam, UK	ab150120	Goat anti-Mouse IgG. Conjugation: Alexa Fluor 594. Ex: 590 nm, Em: 617 nm. Use at 1:500 dilution.
Goat anti-Rabbit IgG secondary antibody	Abcam, UK	ab150077	Goat Anti-Rabbit IgG. Conjugation: Alexa Fluor 488. Ex: 495 nm, Em: 519 nm. Use at 1:500 dilution.
Heparin	Merck, Germany	H3149
Horizontal shaker	Servicebio, China	DS-H200	Relative centrifugal force (RCF) of 0.11808 x g is more appropriate, according to the manufacturer INFORS HT (Switzerland).
Insulin	Merck, Germany	I9278-5ML
KOSR	Thermo Fisher Scientific, USA	10828028
Matrigel	Corning, USA	354277	Matrigel will solidify in the environment higher than 4 °C, so it should be sub packed at low temperature.
MEM-NEAA	Thermo Fisher Scientific, USA	11140050
mTeSR1	STEMCELL Technologies, Canada	85850	iPSC culture medium
N2 supplement	Thermo Fisher Scientific, USA	17502048
Neurobasal	Thermo Fisher Scientific, USA	21103049
OCT4 primary antibody	Abcam, UK	ab19857	Host: Rabbit. Dissolve with 500 μL PBS. Use at 1:200 dilution.
Pathological frozen slicer	Leica, Germany	Leica CM1860
PAX6 primary antibody	Abcam, UK	ab78545	Host: Mouse. Use at 1:100 dilution.
PBS	STEMCELL Technologies, Canada	37350
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific, USA	15140122
PSC dissociation solution	Beijing Saibei Biotechnology, China	CA3001500	Enzyme free dissociation solution can be used for iPSC digestion and passage.
Sendai Reprogramming Kit	Thermo Fisher Scientific, USA	A16518	Establish iPSC according to the protocol of Sendai Reprogramming Kit.
Slide Glass	Shitai Laboratory Equipment, China	188105W
Soft light lamp	NUT	NUT	A simple self made device, refer to supplementary figure 2 for preparation.
STEMdiff Cerebral Organoid Kit	STEMCELL Technologies, Canada	8570	Contain: 1. EB Formation Medium; 2. Induction Medium; 3. Expansion Medium; 4. Maturation Medium.
STEMdiff Cerebral Organoid Maturation Kit	STEMCELL Technologies, Canada	8571	Maturation Medium
Sucrose	Sangon Bioteach, China	A502792
Triton X-100	Merck, Germany	X100
TUJ1 primary antibody	Abcam, UK	ab41489	Host: Chicken. Use at 1:1000 dilution.
Vaseline	Sangon Bioteach, China	A510146
Y-27632	STEMCELL Technologies, Canada	72302	Prepare a 5 mM stock solution in PBS, resuspend 1 mg in 624 µL of PBS.
Weblink
Raw sequencing data	Genome Sequence Archive (Genomics, Proteomics & Bioinformatics 2021) in National Genomics Data Center (Nucleic Acids Res 2022), China National Center for Bioinformation / Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences	GSA-Human: HRA002430	https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/