Facilitar el cultivo de organoides cerebrales a través de la iluminación lateral de luz suave
Summary
Los organoides cerebrales proporcionan oportunidades sin precedentes para estudiar el desarrollo de órganos y la patología de enfermedades humanas. Aunque se ha logrado un gran éxito con los sistemas de cultivo de organoides cerebrales, todavía existen dificultades operativas en la aplicación de esta tecnología. El presente protocolo describe un procedimiento organoide cerebral que facilita el cambio medio y la transferencia de organoides.
Abstract
En la actualidad, la tecnología de cultivo de organoides cerebrales sigue siendo complicada de operar y difícil de aplicar a gran escala. Es necesario encontrar una solución simple y práctica. Por lo tanto, en el presente estudio se propone un protocolo organoide cerebral más factible. Para resolver los inconvenientes inevitables en el cambio medio y la transferencia de organoides en la etapa inicial, la investigación actual optimiza la tecnología de operación mediante la aplicación del principio de ingeniería. Se adoptó una lámpara de luz suave para iluminar lateralmente las muestras del cuerpo embrionario (EB), lo que permite que los EB se vean a simple vista a través del efecto de reflexión difusa mejorado. Utilizando el principio de flujo secundario generado por rotación, los organoides se reúnen hacia el centro del pozo, lo que facilita la operación de cambio de medio o transferencia de organoides. En comparación con la célula dispersa, el cuerpo embrionario se asienta más rápido en la pipeta. Usando este fenómeno, la mayoría de las células libres y los fragmentos de células muertas se pueden eliminar de manera efectiva de una manera simple, evitando que los EB incurran en daños por centrifugación. Este estudio facilita el funcionamiento del cultivo de organoides cerebrales y ayuda a promover la aplicación de organoides cerebrales.
Introduction
En comparación con los sistemas de cultivo bidimensionales (2D), los sistemas de cultivo tridimensionales (3D) tienen varias ventajas, incluida la replicación genuina y la reproducción eficiente de estructuras complejas de ciertos órganos1. Por lo tanto, los organoides cerebrales son uno de los métodos auxiliares importantes para los campos de investigación del desarrollo del cerebro humano y la enfermedad2, la detección de drogas y la terapia celular.
El cultivo de organoides cerebrales por el método de suspensión rotativa es propicio para su desarrollo y maduración3. Aunque los sistemas de cultivo de organoides cerebrales han logrado un gran éxito, todavía se enfrentan a desafíos críticos que limitan su aplicación. Por ejemplo, el cultivo manual implica pasos de manipulación complicados e introduce obstáculos para lograr aplicaciones a gran escala. Además, en cada etapa del desarrollo en el cultivo de organoides cerebrales, se necesitan cambios en diferentes medios y citoquinas4. Sin embargo, en la etapa temprana, los organoides o EB tienen tamaños pequeños (aproximadamente 200 μm a 300 μm) y son casi visualmente inaccesibles sin el aparato adecuado. Inevitablemente, una cierta cantidad de preciosas muestras de organoides se eliminan cuando se cambia el medio. Se han explorado muchas técnicas para superar esto en otros tipos de cultivos de organoides, y algunos ejemplos incluyen sumergir chips organoides enteros en un medio de cultivo durante 3 días sin intervención5; agregar un medio fresco a través de la cubierta después de que el medio viejo se absorba con papel absorbente5; o la aplicación de tuberías microfluídicas complejas para el intercambio de fluidos 6,7,8. Otro obstáculo encontrado en la etapa temprana del cultivo de organoides es la dificultad de lograr observaciones directas a simple vista, lo que puede causar operaciones deficientes que conducen a daños y pérdidas de organoides durante los pasos de transferencia de organoides. Por lo tanto, es necesario establecer un protocolo más factible que facilite el cambio medio y la transferencia de organoides para generar organoides.
Se propone una operación optimizada correspondiente basada en principios de ingeniería para superar estos problemas, lo que facilita de manera significativa y conveniente muchos procedimientos organoides. En la naturaleza, cuando el sol brilla en una casa a través de un hueco en la ventana, el ojo desnudo puede ver el polvo bailando en el haz de luz. Debido al reflejo difuso de la luz solar sobre el polvo, parte de la luz se refracta en el globo ocular para producir una imagen visual. Inspirado en el principio de este fenómeno 9,10, este estudio hizo una lámpara de luz suave e iluminó los EB lateralmente. Se encontró que los EB podían ser visualmente claros sin afectar el alcance de visualización. Se genera un flujo secundario que apunta al centro en el líquido girando la placa de cultivo debido a las corrientes de Foucault11. Los EB originalmente dispersos se acumulan en el centro de la placa. En base a esto, y al fenómeno de que la velocidad de sedimentación de los organoides es más rápida que la de las células, se propone un método de fácil operación de cambio de medio y transferencia de organoides sin centrifugación. Los organoides en el medio de cultivo se pueden separar eficazmente de las células libres y los fragmentos de células muertas a través de esta operación de transferencia.
Aquí, se propone un protocolo que es fácil de operar para generar organoides cerebrales a partir de células madre pluripotentes humanas. La tecnología de operación se optimizó aplicando el principio de ingeniería, haciendo que las operaciones en la cultura 3D sean tan simples y factibles como las de la cultura 2D. El método mejorado de intercambio de líquidos y la operación de transferencia de organoides también son útiles para otros tipos de cultivo de organoides y el diseño de máquinas de cultivo automático.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los organoides cerebrales abren nuevas vías para la investigación médica. Muchas aplicaciones útiles de esta tecnología apenas están comenzando a ser exploradas28. Esta investigación encontró que los resultados de la secuenciación del transcriptoma de los organoides cerebrales genéticamente enfermos y los organoides cerebrales normales pueden reflejar las diferencias entre la enfermedad y la salud. Por ejemplo, los resultados del análisis de datos de ARN-seq (Figura…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Guangdong (Subvención No. 2020A0505100062), el Proyecto de Temas Clave de Ciencia y Tecnología de la Ciudad de Guangzhou (Subvención No. 201904020025), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvención Nos. 31872800, 32070582, 82101937) y el proyecto de Beca de Investigación Postdoctoral de la Ciudad de Guangzhou (a Bangzhu Chen).
Materials
| 0.2 μm Filter | NEST Biotechnology, China | 331001 | |
| 1000 μL wide-bore pipette tip | Thermo Fisher Scientific, USA | 9405163 | |
| 200 μL wide-bore pipette tip | Thermo Fisher Scientific, USA | 9405020 | |
| 2-Mercaptoethanol | Merck, Germany | 8057400005 | |
| 4% Paraformaldehyde | Servicebio, China | G1101 | |
| 6-well low adhesion plate | NEST Biotechnology, China | 703011 | It is used for EBs suspension cultures |
| Aaccute cell detachment solution | STEMCELL Technologies, Canada | 07920 | It is used to digest iPSC into single cells. |
| AggreWell800 24-well | STEMCELL Technologies, Canada | 34811 | Microporous culture plate for EBs preparation. |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL Technologies, Canada | 07010 | Rinsing solution for cultureware to prevent cell adhesion |
| B27-vit. A supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 12587010 | |
| bFGF | Peprotech, USA | GMP100-18B | |
| BSA | Beyotime Biotechnology, China | ST025 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5810 R | It can be used for centrifugation of various types of centrifuge tubes, reagent bottles and working plates. |
| Cover glass | Shitai Laboratory Equipment, China | 10212020C | |
| DAPI | Beyotime Biotechnology, China | C1002 | Used for nuclear staining. After DAPI was combined with double stranded DNA, the maximum excitation wavelength was 364nm and the maximum emission wavelength was 454nm. |
| DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific, USA | 11330032 | |
| ES-quality FBS | Thermo Fisher Scientific, USA | 10270106 | |
| Ficoll Paque | General Electric Company, USA | 17-5442-02 | Isolate the peripheral blood mononuclear cells according to Ficoll-Paque method. |
| Gelatin | Sangon Bioteach, China | A609764 | |
| Glutamax supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 35050061 | |
| Glutamax supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 17504044 | |
| Goat anti-Chicken IgY secondary antibody | Abcam, UK | ab150171 | Goat anti-Chicken IgG. Conjugation: Alexa Fluor 647. Ex: 652 nm, Em: 668 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Goat anti-Mouse IgG secondary antibody | Abcam, UK | ab150120 | Goat anti-Mouse IgG. Conjugation: Alexa Fluor 594. Ex: 590 nm, Em: 617 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Goat anti-Rabbit IgG secondary antibody | Abcam, UK | ab150077 | Goat Anti-Rabbit IgG. Conjugation: Alexa Fluor 488. Ex: 495 nm, Em: 519 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Heparin | Merck, Germany | H3149 | |
| Horizontal shaker | Servicebio, China | DS-H200 | Relative centrifugal force (RCF) of 0.11808 x g is more appropriate, according to the manufacturer INFORS HT (Switzerland). |
| Insulin | Merck, Germany | I9278-5ML | |
| KOSR | Thermo Fisher Scientific, USA | 10828028 | |
| Matrigel | Corning, USA | 354277 | Matrigel will solidify in the environment higher than 4 °C, so it should be sub packed at low temperature. |
| MEM-NEAA | Thermo Fisher Scientific, USA | 11140050 | |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies, Canada | 85850 | iPSC culture medium |
| N2 supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 17502048 | |
| Neurobasal | Thermo Fisher Scientific, USA | 21103049 | |
| OCT4 primary antibody | Abcam, UK | ab19857 | Host: Rabbit. Dissolve with 500 μL PBS. Use at 1:200 dilution. |
| Pathological frozen slicer | Leica, Germany | Leica CM1860 | |
| PAX6 primary antibody | Abcam, UK | ab78545 | Host: Mouse. Use at 1:100 dilution. |
| PBS | STEMCELL Technologies, Canada | 37350 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, USA | 15140122 | |
| PSC dissociation solution | Beijing Saibei Biotechnology, China | CA3001500 | Enzyme free dissociation solution can be used for iPSC digestion and passage. |
| Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific, USA | A16518 | Establish iPSC according to the protocol of Sendai Reprogramming Kit. |
| Slide Glass | Shitai Laboratory Equipment, China | 188105W | |
| Soft light lamp | NUT | NUT | A simple self made device, refer to supplementary figure 2 for preparation. |
| STEMdiff Cerebral Organoid Kit | STEMCELL Technologies, Canada | 8570 | Contain: 1. EB Formation Medium; 2. Induction Medium; 3. Expansion Medium; 4. Maturation Medium. |
| STEMdiff Cerebral Organoid Maturation Kit | STEMCELL Technologies, Canada | 8571 | Maturation Medium |
| Sucrose | Sangon Bioteach, China | A502792 | |
| Triton X-100 | Merck, Germany | X100 | |
| TUJ1 primary antibody | Abcam, UK | ab41489 | Host: Chicken. Use at 1:1000 dilution. |
| Vaseline | Sangon Bioteach, China | A510146 | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies, Canada | 72302 | Prepare a 5 mM stock solution in PBS, resuspend 1 mg in 624 µL of PBS. |
| Weblink | |||
| Raw sequencing data | Genome Sequence Archive (Genomics, Proteomics & Bioinformatics 2021) in National Genomics Data Center (Nucleic Acids Res 2022), China National Center for Bioinformation / Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences | GSA-Human: HRA002430 | https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/ |
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