Yanal Yumuşak Işık Aydınlatması ile Serebral Organoid Kültürün Kolaylaştırılması
Summary
Serebral organoidler, organ gelişimini ve insan hastalığı patolojisini incelemek için benzeri görülmemiş fırsatlar sunar. Serebral organoid kültür sistemleri ile büyük başarılar elde edilmiş olsa da, bu teknolojinin uygulanmasında hala operasyonel zorluklar yaşanmaktadır. Mevcut protokol, orta değişim ve organoid transferini kolaylaştıran serebral organoid bir prosedürü tanımlamaktadır.
Abstract
Şu anda, serebral organoid kültür teknolojisinin işletilmesi hala karmaşıktır ve büyük ölçekte uygulanması zordur. Basit ve pratik bir çözüm bulmak gerekiyor. Bu nedenle, bu çalışmada daha uygulanabilir bir serebral organoid protokol önerilmiştir. Orta değişim ve organoid transferindeki kaçınılmaz rahatsızlığı erken aşamada çözmek için, mevcut araştırma mühendislik ilkesini uygulayarak işletme teknolojisini optimize etmektedir. Embriyoid cisim (EB) örneklerini yanal olarak aydınlatmak için yumuşak bir ışık lambası benimsendi ve EB’lerin gelişmiş dağınık yansıma etkisi ile çıplak gözle görülmesini sağladı. Rotasyonla üretilen ikincil akış prensibini kullanarak, organoidler kuyunun merkezine doğru toplanır ve bu da orta değişimin veya organoid transferin çalışmasını kolaylaştırır. Dağılmış hücreye kıyasla, embriyoid vücut pipete daha hızlı yerleşir. Bu fenomeni kullanarak, serbest hücrelerin ve ölü hücre parçalarının çoğu, EB’lerin santrifüjlemeden zarar görmesini önleyerek basit bir şekilde etkili bir şekilde çıkarılabilir. Bu çalışma, serebral organoid kültürünün çalışmasını kolaylaştırır ve beyin organoidlerinin uygulanmasını teşvik etmeye yardımcı olur.
Introduction
İki boyutlu (2B) kültür sistemleriyle karşılaştırıldığında, üç boyutlu (3B) kültür sistemlerinin, gerçek replikasyon ve belirli organların karmaşık yapılarının verimli bir şekilde çoğaltılması gibi çeşitli avantajları vardır1. Bu nedenle, serebral organoidler, insan beyni gelişimi ve hastalığı2, ilaç taraması ve hücre tedavisi araştırma alanları için önemli yardımcı yöntemlerden biridir.
Serebral organoidlerin döner süspansiyon yöntemiyle kültürlenmesi, gelişimlerine ve olgunlaşmalarına elverişlidir3. Serebral organoid kültür sistemleri büyük başarılar elde etmiş olsalar da, uygulamalarını sınırlayan kritik zorluklarla karşı karşıyadırlar. Örneğin, manuel yetiştirme karmaşık manipülasyon adımlarını içerir ve büyük ölçekli uygulamalara ulaşmanın önünde engeller getirir. Ek olarak, serebral organoidlerin kültüründeki her gelişim aşamasında, farklı ortam ve sitokinlerde değişikliklere ihtiyaçvardır4. Bununla birlikte, erken aşamada, organoidler veya EB’ler küçük boyutlara (yaklaşık 200 μm ila 300 μm) sahiptir ve uygun aparatlar olmadan neredeyse görsel olarak erişilemez. Kaçınılmaz olarak, ortam değiştirildiğinde belirli miktarda değerli organoid numune temizlenir. Diğer organoid kültürlerde bunun üstesinden gelmek için birçok teknik araştırılmıştır ve bazı örnekler arasında tüm organoid cipslerin müdahale edilmeden 3 gün boyunca bir kültür ortamına daldırılması5; eski ortam emici kağıt5 kullanılarak emildikten sonra kapak kapağından taze bir ortam eklenmesi; veya sıvı değişimi için karmaşık mikroakışkan boru hatları uygulamak 6,7,8. Organoid yetiştiriciliğinin erken evresinde karşılaşılan bir diğer engel, çıplak gözle doğrudan gözlemler elde etmenin zorluğudur ve bu da organoid transfer adımları sırasında organoid hasarına ve kaybına yol açan zayıf operasyonlara neden olabilir. Bu nedenle, organoidler üretmek için ortam değişimini ve organoid transferini kolaylaştıran daha uygulanabilir bir protokol oluşturmak gerekir.
Birçok organoid prosedürü önemli ölçüde ve uygun bir şekilde kolaylaştıran bu sorunların üstesinden gelmek için mühendislik ilkelerine dayanan karşılık gelen optimize edilmiş bir çalışma önerilmektedir. Doğada, güneş bir pencere boşluğundan bir eve parladığında, çıplak gözle ışık huzmesinde dans eden tozu görebilir. Güneş ışığının toz üzerindeki dağınık yansıması nedeniyle, görsel bir görüntü üretmek için bir miktar ışık göz küresine kırılır. Bu fenomenin 9,10 prensibinden esinlenen bu çalışma, yumuşak bir ışık lambası yaptı ve EB’leri yanal olarak aydınlattı. EB’lerin görüntüleme kapsamını etkilemeden görsel olarak net olabileceği bulunmuştur. Girdap akımları nedeniyle kültür plakası döndürülerek sıvıda merkeze işaret eden ikincil bir akış üretilir11. Başlangıçta dağılmış EB’ler plakanın merkezinde birikir. Buna ve organoidlerin çökelme hızının hücrelerinkinden daha hızlı olduğu olgusuna dayanarak, santrifüjleme olmadan orta değişim ve organoid transferinin kolay bir çalışma yöntemi önerilmektedir. Kültür ortamındaki organoidler, bu transfer işlemi ile serbest hücrelerden ve ölü hücre parçalarından etkili bir şekilde ayrılabilir.
Burada, insan pluripotent kök hücrelerinden serebral organoidler üretmek için kullanımı kolay bir protokol önerilmektedir. Operasyon teknolojisi, mühendislik ilkesi uygulanarak, 3D kültürdeki işlemleri 2D kültüründekiler kadar basit ve uygulanabilir hale getirerek optimize edildi. Geliştirilmiş sıvı değişim yöntemi ve organoid transfer işlemi, diğer organoid kültür türleri ve otomatik kültür makinelerinin tasarımı için de yararlıdır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Serebral organoidler tıbbi araştırmalar için yeni yollar açar. Bu teknolojinin birçok yararlı uygulaması henüz keşfedilmeye başlanmıştır28. Bu araştırma, genetik olarak hastalıklı serebral organoidlerin ve normal serebral organoidlerin transkriptom dizileme sonuçlarının hastalık ve sağlık arasındaki farkları yansıtabileceğini bulmuştur. Örneğin, RNA-seq veri analizi sonuçları (Şekil 3B), SCA3 hastalıkları<sup class="xref…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Guangdong Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (Hibe No. 2020A0505100062), Guangzhou Şehri Bilim ve Teknoloji Anahtar Konular Projesi (Hibe No. 201904020025), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Hibe No. 31872800, 32070582, 82101937) ve Guangzhou Şehri Doktora Sonrası Araştırma Hibe projesi (Bangzhu Chen’e) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 0.2 μm Filter | NEST Biotechnology, China | 331001 | |
| 1000 μL wide-bore pipette tip | Thermo Fisher Scientific, USA | 9405163 | |
| 200 μL wide-bore pipette tip | Thermo Fisher Scientific, USA | 9405020 | |
| 2-Mercaptoethanol | Merck, Germany | 8057400005 | |
| 4% Paraformaldehyde | Servicebio, China | G1101 | |
| 6-well low adhesion plate | NEST Biotechnology, China | 703011 | It is used for EBs suspension cultures |
| Aaccute cell detachment solution | STEMCELL Technologies, Canada | 07920 | It is used to digest iPSC into single cells. |
| AggreWell800 24-well | STEMCELL Technologies, Canada | 34811 | Microporous culture plate for EBs preparation. |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL Technologies, Canada | 07010 | Rinsing solution for cultureware to prevent cell adhesion |
| B27-vit. A supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 12587010 | |
| bFGF | Peprotech, USA | GMP100-18B | |
| BSA | Beyotime Biotechnology, China | ST025 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5810 R | It can be used for centrifugation of various types of centrifuge tubes, reagent bottles and working plates. |
| Cover glass | Shitai Laboratory Equipment, China | 10212020C | |
| DAPI | Beyotime Biotechnology, China | C1002 | Used for nuclear staining. After DAPI was combined with double stranded DNA, the maximum excitation wavelength was 364nm and the maximum emission wavelength was 454nm. |
| DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific, USA | 11330032 | |
| ES-quality FBS | Thermo Fisher Scientific, USA | 10270106 | |
| Ficoll Paque | General Electric Company, USA | 17-5442-02 | Isolate the peripheral blood mononuclear cells according to Ficoll-Paque method. |
| Gelatin | Sangon Bioteach, China | A609764 | |
| Glutamax supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 35050061 | |
| Glutamax supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 17504044 | |
| Goat anti-Chicken IgY secondary antibody | Abcam, UK | ab150171 | Goat anti-Chicken IgG. Conjugation: Alexa Fluor 647. Ex: 652 nm, Em: 668 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Goat anti-Mouse IgG secondary antibody | Abcam, UK | ab150120 | Goat anti-Mouse IgG. Conjugation: Alexa Fluor 594. Ex: 590 nm, Em: 617 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Goat anti-Rabbit IgG secondary antibody | Abcam, UK | ab150077 | Goat Anti-Rabbit IgG. Conjugation: Alexa Fluor 488. Ex: 495 nm, Em: 519 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Heparin | Merck, Germany | H3149 | |
| Horizontal shaker | Servicebio, China | DS-H200 | Relative centrifugal force (RCF) of 0.11808 x g is more appropriate, according to the manufacturer INFORS HT (Switzerland). |
| Insulin | Merck, Germany | I9278-5ML | |
| KOSR | Thermo Fisher Scientific, USA | 10828028 | |
| Matrigel | Corning, USA | 354277 | Matrigel will solidify in the environment higher than 4 °C, so it should be sub packed at low temperature. |
| MEM-NEAA | Thermo Fisher Scientific, USA | 11140050 | |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies, Canada | 85850 | iPSC culture medium |
| N2 supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 17502048 | |
| Neurobasal | Thermo Fisher Scientific, USA | 21103049 | |
| OCT4 primary antibody | Abcam, UK | ab19857 | Host: Rabbit. Dissolve with 500 μL PBS. Use at 1:200 dilution. |
| Pathological frozen slicer | Leica, Germany | Leica CM1860 | |
| PAX6 primary antibody | Abcam, UK | ab78545 | Host: Mouse. Use at 1:100 dilution. |
| PBS | STEMCELL Technologies, Canada | 37350 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, USA | 15140122 | |
| PSC dissociation solution | Beijing Saibei Biotechnology, China | CA3001500 | Enzyme free dissociation solution can be used for iPSC digestion and passage. |
| Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific, USA | A16518 | Establish iPSC according to the protocol of Sendai Reprogramming Kit. |
| Slide Glass | Shitai Laboratory Equipment, China | 188105W | |
| Soft light lamp | NUT | NUT | A simple self made device, refer to supplementary figure 2 for preparation. |
| STEMdiff Cerebral Organoid Kit | STEMCELL Technologies, Canada | 8570 | Contain: 1. EB Formation Medium; 2. Induction Medium; 3. Expansion Medium; 4. Maturation Medium. |
| STEMdiff Cerebral Organoid Maturation Kit | STEMCELL Technologies, Canada | 8571 | Maturation Medium |
| Sucrose | Sangon Bioteach, China | A502792 | |
| Triton X-100 | Merck, Germany | X100 | |
| TUJ1 primary antibody | Abcam, UK | ab41489 | Host: Chicken. Use at 1:1000 dilution. |
| Vaseline | Sangon Bioteach, China | A510146 | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies, Canada | 72302 | Prepare a 5 mM stock solution in PBS, resuspend 1 mg in 624 µL of PBS. |
| Weblink | |||
| Raw sequencing data | Genome Sequence Archive (Genomics, Proteomics & Bioinformatics 2021) in National Genomics Data Center (Nucleic Acids Res 2022), China National Center for Bioinformation / Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences | GSA-Human: HRA002430 | https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/ |
References
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7 (33), (2020).
- Quadrato, G., et al. Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids. Nature. 545 (7652), 48-53 (2017).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Qian, X., et al. et al.Brain-region-specific organoids using mini-bioreactors for modeling ZIKV exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Hu, Y., et al. Lung cancer organoids analyzed on microwell arrays predict drug responses of patients within a week. Nature Communications. 12 (1), 2581 (2021).
- Jung, D. J., et al. A one-stop microfluidic-based lung cancer organoid culture platform for testing drug sensitivity. Lab on a Chip. 19 (17), 2854-2865 (2019).
- Jalili-Firoozinezhad, S., et al. A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 520-531 (2019).
- Gkatzis, K., Taghizadeh, S., Huh, D., Stainier, D. Use of three-dimensional organoids and lung-on-a-chip methods to study lung development, regeneration and disease. The European Respiratory Journal. 52 (5), 1800876 (2018).
- Ye, Y., Pui, D. Detection of nanoparticles suspended in a light scattering medium. Scientific Reports. 11 (1), 20268 (2021).
- Staven, V., Waaseth, M., Wang, S., Grønlie, I., Tho, I. Utilization of the tyndall effect for enhanced visual detection of particles in compatibility testing of intravenous fluids: Validity and reliability. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology. 69 (2), 270-283 (2015).
- Fukuma, Y., Inui, T., Imashiro, C., Kurashina, Y., Takemura, K. Homogenization of initial cell distribution by secondary flow of medium improves cell culture efficiency. PloS One. 15 (7), 0235827 (2020).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Ouyang, S., et al. CRISPR/Cas9-targeted deletion of polyglutamine in spinocerebellar ataxia type 3-derived induced pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 27 (11), 756-770 (2018).
- Xian, Y., et al. The safety and effectiveness of genetically corrected iPSCs derived from β-thalassaemia patients in nonmyeloablative β-thalassaemic mice. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 288 (2020).
- Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Current Protocols in Immunology. , (2001).
- Knight, G. T., et al. Engineering induction of singular neural rosette emergence within hPSC-derived tissues. eLife. 7, 37549 (2018).
- Rieder, H. L., Smithwick, R. W. RPM or RCF. The American Review of Respiratory Disease. 132 (6), 1371 (1985).
- Dole, V. P., Cotzias, G. C. A nomogram for the calculation of relative centrifugal force. Science. 113 (2941), 552-553 (1951).
- Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).
- Jacob, F., et al. Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium. Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).
- Kathuria, A., et al. Transcriptomic landscape and functional characterization of induced pluripotent stem cell-derived cerebral organoids in schizophrenia. JAMA Psychiatry. 77 (7), 745-754 (2020).
- Paşca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nature Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
- Hu, B. Y., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4335-4340 (2010).
- Tang, X. Y., et al. DSCAM/PAK1 pathway suppression reverses neurogenesis deficits in iPSC-derived cerebral organoids from patients with Down syndrome. The Journal of Clinical Investigation. 131 (12), 135763 (2021).
- Costa, M., Paulson, H. L. Toward understanding Machado-Joseph disease. Progress in Neurobiology. 97 (2), 239-257 (2012).
- Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nature Biotechnology. 28 (5), 511-515 (2010).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Klockgether, T., et al. Age related axonal neuropathy in spinocerebellar ataxia type 3/Machado-Joseph disease (SCA3/MJD). Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 66 (2), 222-224 (1999).
- Khan, L. A., et al. Expanded polyglutamines impair synaptic transmission and ubiquitin-proteasome system in Caenorhabditis elegans. Journal of Neurochemistry. 98 (2), 576-587 (2006).
- Teixeira-Castro, A., et al. Serotonergic signalling suppresses ataxin 3 aggregation and neurotoxicity in animal models of Machado-Joseph disease. Brain: A Journal of Neurology. 138, 3221-3237 (2015).
- Joers, J. M., et al. Neurochemical abnormalities in premanifest and early spinocerebellar ataxias. Annals of Neurology. 83 (4), 816-829 (2018).
- Sivitilli, A., Ghiasi, P., Attisano, L. Production of phenotypically uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Bio-protocol. 11 (8), 3985 (2021).
- Sivitilli, A. A., et al. Robust production of uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Life Science Alliance. 3 (5), (2020).
- Camp, J. G., Treutlein, B. Human development: Advances in mini-brain technology. Nature. 545 (7652), 39-40 (2017).
- Giandomenico, S. L., Sutcliffe, M., Lancaster, M. A. Generation and long-term culture of advanced cerebral organoids for studying later stages of neural development. Nature Protocols. 16 (2), 579-602 (2021).
- Yoon, S. J., et al. Reliability of human cortical organoid generation. Nature Methods. 16 (1), 75-78 (2019).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).
