Tilrettelegging av cerebral organoidkultur via lateral myk lysbelysning
Summary
Cerebrale organoider gir enestående muligheter for å studere organutvikling og menneskelig sykdomspatologi. Selv om stor suksess er oppnådd med cerebrale organoidkultursystemer, er det fortsatt operasjonelle vanskeligheter med å anvende denne teknologien. Denne protokollen beskriver en cerebral organoid prosedyre som muliggjør medium endring og organoidoverføring.
Abstract
For tiden er cerebral organoid kulturteknologi fortsatt komplisert å operere og vanskelig å anvende i stor skala. Det er nødvendig å finne en enkel og praktisk løsning. Derfor foreslås en mer gjennomførbar cerebral organoidprotokoll i denne studien. For å løse den uunngåelige ulempen ved mediumendring og organoidoverføring i tidlig fase, optimaliserer dagens forskning operasjonsteknologien ved å anvende ingeniørprinsippet. En myk lyslampe ble vedtatt for å lateralt belyse embryoidlegemet (EB) prøver, slik at EB-ene kan ses med det blotte øye gjennom den forbedrede diffuse refleksjonseffekten. Ved å bruke prinsippet om sekundær strømning generert ved rotasjon, samles organoider mot midten av brønnen, noe som letter driften av mediumendring eller organoidoverføring. Sammenlignet med den dispergerte cellen, legger den embryoide kroppen seg raskere i pipetten. Ved hjelp av dette fenomenet kan de fleste frie celler og døde cellefragmenter effektivt fjernes på en enkel måte, og forhindrer at EB-er pådrar seg skade fra sentrifugering. Denne studien letter driften av cerebral organoidkultur og bidrar til å fremme anvendelsen av hjerneorganoider.
Introduction
Sammenlignet med todimensjonale (2D) kultursystemer har tredimensjonale (3D) kultursystemer flere fordeler, inkludert ekte replikasjon og effektiv reproduksjon av komplekse strukturer i visse organer1. Derfor er cerebrale organoider en av de viktige hjelpemetodene for forskningsfeltene menneskelig hjerneutvikling og sykdom2, narkotikascreening og celleterapi.
Dyrking av cerebrale organoider ved den roterende suspensjonsmetoden bidrar til deres utvikling og modning3. Selv om cerebrale organoidkultursystemer har oppnådd stor suksess, står de fortsatt overfor kritiske utfordringer som begrenser deres anvendelse. For eksempel innebærer manuell dyrking kompliserte manipulasjonstrinn og introduserer hindringer for å oppnå store applikasjoner. I tillegg, i hvert utviklingsstadium i kulturen av cerebrale organoider, er det nødvendig med endringer i forskjellige medier og cytokiner4. Men i det tidlige stadiet har organoider eller EB små størrelser (ca. 200 μm til 300 μm) og er nesten visuelt utilgjengelige uten passende apparater. Uunngåelig skylles en viss mengde dyrebare organoidprøver bort når mediet endres. Mange teknikker har blitt utforsket for å overvinne dette i andre typer organoidkulturer, og noen eksempler inkluderer nedsenking av hele organoid chips i et kulturmedium i 3 dager uten inngrep5; tilsett et nytt medium gjennom dekslene etter at det gamle mediet er absorbert ved bruk av absorberende papir5; eller bruk av komplekse mikrofluidiske rørledninger for væskeutveksling 6,7,8. En annen hindring som oppstår i det tidlige stadiet av organoid dyrking er vanskeligheten med å oppnå direkte observasjoner med det blotte øye, noe som kan forårsake dårlige operasjoner som fører til organoid skade og tap under organoidoverføringstrinnene. Derfor er det nødvendig å etablere en mer gjennomførbar protokoll som letter medium forandring og organoidoverføring for å generere organoider.
En tilsvarende optimalisert operasjon basert på tekniske prinsipper foreslås for å overvinne disse problemene, noe som betydelig og praktisk letter mange organoidprosedyrer. I naturen, når solen skinner inn i et hus gjennom et vindusgap, kan det blotte øye se støvet danse i lysstrålen. På grunn av den diffuse refleksjonen av sollys på støv, brytes noe lys inn i øyebollet for å produsere et visuelt bilde. Inspirert av prinsippet om dette fenomenet 9,10, gjorde denne studien en myk lyslampe og opplyste EB-ene sideveis. Det ble funnet at EB-er kunne være visuelt klare uten å påvirke visningsomfanget. En sekundær strømning som peker mot midten genereres i væsken ved å rotere kulturplaten på grunn av virvelstrømmer11. Opprinnelig dispergerte EB-er akkumuleres i midten av platen. Basert på dette, og fenomenet at sedimenteringshastigheten til organoider er raskere enn cellenes, foreslås en enkel operasjonsmetode for mediumendring og organoidoverføring uten sentrifugering. Organoidene i kulturmediet kan effektivt skilles fra frie celler og døde cellefragmenter gjennom denne overføringsoperasjonen.
Her foreslås en protokoll som er enkel å betjene for å generere cerebrale organoider fra humane pluripotente stamceller. Operasjonsteknologien ble optimalisert ved å bruke ingeniørprinsippet, noe som gjorde operasjoner i 3D-kultur like enkle og gjennomførbare som de i 2D-kulturen. Den forbedrede væskeutvekslingsmetoden og organoidoverføringsoperasjonen er også nyttig for andre typer organoidkultur og utformingen av automatiske kulturmaskiner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cerebrale organoider åpner nye veier for medisinsk forskning. Mange nyttige anvendelser av denne teknologien begynner bare å bli utforsket28. Denne undersøkelsen fant at transkriptomsekvenseringsresultatene av genetisk syke cerebrale organoider og normale cerebrale organoider kan gjenspeile forskjellene mellom sykdom og helse. For eksempel er RNA-seq dataanalyseresultatene (figur 3B) i samsvar med mange rapporterte studier på SCA3 sykdommer 29,30,31,32.<sup class=…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble støttet av Natural Science Foundation of Guangdong-provinsen (Grant No. 2020A0505100062), Guangzhou City Science and Technology Key Topics Project (Grant No. 201904020025), National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 31872800, 32070582, 82101937) og Guangzhou City Postdoctoral Research Grant-prosjektet (til Bangzhu Chen).
Materials
| 0.2 μm Filter | NEST Biotechnology, China | 331001 | |
| 1000 μL wide-bore pipette tip | Thermo Fisher Scientific, USA | 9405163 | |
| 200 μL wide-bore pipette tip | Thermo Fisher Scientific, USA | 9405020 | |
| 2-Mercaptoethanol | Merck, Germany | 8057400005 | |
| 4% Paraformaldehyde | Servicebio, China | G1101 | |
| 6-well low adhesion plate | NEST Biotechnology, China | 703011 | It is used for EBs suspension cultures |
| Aaccute cell detachment solution | STEMCELL Technologies, Canada | 07920 | It is used to digest iPSC into single cells. |
| AggreWell800 24-well | STEMCELL Technologies, Canada | 34811 | Microporous culture plate for EBs preparation. |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL Technologies, Canada | 07010 | Rinsing solution for cultureware to prevent cell adhesion |
| B27-vit. A supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 12587010 | |
| bFGF | Peprotech, USA | GMP100-18B | |
| BSA | Beyotime Biotechnology, China | ST025 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5810 R | It can be used for centrifugation of various types of centrifuge tubes, reagent bottles and working plates. |
| Cover glass | Shitai Laboratory Equipment, China | 10212020C | |
| DAPI | Beyotime Biotechnology, China | C1002 | Used for nuclear staining. After DAPI was combined with double stranded DNA, the maximum excitation wavelength was 364nm and the maximum emission wavelength was 454nm. |
| DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific, USA | 11330032 | |
| ES-quality FBS | Thermo Fisher Scientific, USA | 10270106 | |
| Ficoll Paque | General Electric Company, USA | 17-5442-02 | Isolate the peripheral blood mononuclear cells according to Ficoll-Paque method. |
| Gelatin | Sangon Bioteach, China | A609764 | |
| Glutamax supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 35050061 | |
| Glutamax supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 17504044 | |
| Goat anti-Chicken IgY secondary antibody | Abcam, UK | ab150171 | Goat anti-Chicken IgG. Conjugation: Alexa Fluor 647. Ex: 652 nm, Em: 668 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Goat anti-Mouse IgG secondary antibody | Abcam, UK | ab150120 | Goat anti-Mouse IgG. Conjugation: Alexa Fluor 594. Ex: 590 nm, Em: 617 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Goat anti-Rabbit IgG secondary antibody | Abcam, UK | ab150077 | Goat Anti-Rabbit IgG. Conjugation: Alexa Fluor 488. Ex: 495 nm, Em: 519 nm. Use at 1:500 dilution. |
| Heparin | Merck, Germany | H3149 | |
| Horizontal shaker | Servicebio, China | DS-H200 | Relative centrifugal force (RCF) of 0.11808 x g is more appropriate, according to the manufacturer INFORS HT (Switzerland). |
| Insulin | Merck, Germany | I9278-5ML | |
| KOSR | Thermo Fisher Scientific, USA | 10828028 | |
| Matrigel | Corning, USA | 354277 | Matrigel will solidify in the environment higher than 4 °C, so it should be sub packed at low temperature. |
| MEM-NEAA | Thermo Fisher Scientific, USA | 11140050 | |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies, Canada | 85850 | iPSC culture medium |
| N2 supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 17502048 | |
| Neurobasal | Thermo Fisher Scientific, USA | 21103049 | |
| OCT4 primary antibody | Abcam, UK | ab19857 | Host: Rabbit. Dissolve with 500 μL PBS. Use at 1:200 dilution. |
| Pathological frozen slicer | Leica, Germany | Leica CM1860 | |
| PAX6 primary antibody | Abcam, UK | ab78545 | Host: Mouse. Use at 1:100 dilution. |
| PBS | STEMCELL Technologies, Canada | 37350 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, USA | 15140122 | |
| PSC dissociation solution | Beijing Saibei Biotechnology, China | CA3001500 | Enzyme free dissociation solution can be used for iPSC digestion and passage. |
| Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific, USA | A16518 | Establish iPSC according to the protocol of Sendai Reprogramming Kit. |
| Slide Glass | Shitai Laboratory Equipment, China | 188105W | |
| Soft light lamp | NUT | NUT | A simple self made device, refer to supplementary figure 2 for preparation. |
| STEMdiff Cerebral Organoid Kit | STEMCELL Technologies, Canada | 8570 | Contain: 1. EB Formation Medium; 2. Induction Medium; 3. Expansion Medium; 4. Maturation Medium. |
| STEMdiff Cerebral Organoid Maturation Kit | STEMCELL Technologies, Canada | 8571 | Maturation Medium |
| Sucrose | Sangon Bioteach, China | A502792 | |
| Triton X-100 | Merck, Germany | X100 | |
| TUJ1 primary antibody | Abcam, UK | ab41489 | Host: Chicken. Use at 1:1000 dilution. |
| Vaseline | Sangon Bioteach, China | A510146 | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies, Canada | 72302 | Prepare a 5 mM stock solution in PBS, resuspend 1 mg in 624 µL of PBS. |
| Weblink | |||
| Raw sequencing data | Genome Sequence Archive (Genomics, Proteomics & Bioinformatics 2021) in National Genomics Data Center (Nucleic Acids Res 2022), China National Center for Bioinformation / Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences | GSA-Human: HRA002430 | https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/ |
References
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7 (33), (2020).
- Quadrato, G., et al. Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids. Nature. 545 (7652), 48-53 (2017).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Qian, X., et al. et al.Brain-region-specific organoids using mini-bioreactors for modeling ZIKV exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Hu, Y., et al. Lung cancer organoids analyzed on microwell arrays predict drug responses of patients within a week. Nature Communications. 12 (1), 2581 (2021).
- Jung, D. J., et al. A one-stop microfluidic-based lung cancer organoid culture platform for testing drug sensitivity. Lab on a Chip. 19 (17), 2854-2865 (2019).
- Jalili-Firoozinezhad, S., et al. A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 520-531 (2019).
- Gkatzis, K., Taghizadeh, S., Huh, D., Stainier, D. Use of three-dimensional organoids and lung-on-a-chip methods to study lung development, regeneration and disease. The European Respiratory Journal. 52 (5), 1800876 (2018).
- Ye, Y., Pui, D. Detection of nanoparticles suspended in a light scattering medium. Scientific Reports. 11 (1), 20268 (2021).
- Staven, V., Waaseth, M., Wang, S., Grønlie, I., Tho, I. Utilization of the tyndall effect for enhanced visual detection of particles in compatibility testing of intravenous fluids: Validity and reliability. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology. 69 (2), 270-283 (2015).
- Fukuma, Y., Inui, T., Imashiro, C., Kurashina, Y., Takemura, K. Homogenization of initial cell distribution by secondary flow of medium improves cell culture efficiency. PloS One. 15 (7), 0235827 (2020).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
- Ouyang, S., et al. CRISPR/Cas9-targeted deletion of polyglutamine in spinocerebellar ataxia type 3-derived induced pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 27 (11), 756-770 (2018).
- Xian, Y., et al. The safety and effectiveness of genetically corrected iPSCs derived from β-thalassaemia patients in nonmyeloablative β-thalassaemic mice. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 288 (2020).
- Kanof, M. E., Smith, P. D., Zola, H. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Current Protocols in Immunology. , (2001).
- Knight, G. T., et al. Engineering induction of singular neural rosette emergence within hPSC-derived tissues. eLife. 7, 37549 (2018).
- Rieder, H. L., Smithwick, R. W. RPM or RCF. The American Review of Respiratory Disease. 132 (6), 1371 (1985).
- Dole, V. P., Cotzias, G. C. A nomogram for the calculation of relative centrifugal force. Science. 113 (2941), 552-553 (1951).
- Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).
- Jacob, F., et al. Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium. Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).
- Kathuria, A., et al. Transcriptomic landscape and functional characterization of induced pluripotent stem cell-derived cerebral organoids in schizophrenia. JAMA Psychiatry. 77 (7), 745-754 (2020).
- Paşca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nature Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
- Hu, B. Y., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4335-4340 (2010).
- Tang, X. Y., et al. DSCAM/PAK1 pathway suppression reverses neurogenesis deficits in iPSC-derived cerebral organoids from patients with Down syndrome. The Journal of Clinical Investigation. 131 (12), 135763 (2021).
- Costa, M., Paulson, H. L. Toward understanding Machado-Joseph disease. Progress in Neurobiology. 97 (2), 239-257 (2012).
- Trapnell, C., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nature Biotechnology. 28 (5), 511-515 (2010).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15 (12), 550 (2014).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Klockgether, T., et al. Age related axonal neuropathy in spinocerebellar ataxia type 3/Machado-Joseph disease (SCA3/MJD). Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry. 66 (2), 222-224 (1999).
- Khan, L. A., et al. Expanded polyglutamines impair synaptic transmission and ubiquitin-proteasome system in Caenorhabditis elegans. Journal of Neurochemistry. 98 (2), 576-587 (2006).
- Teixeira-Castro, A., et al. Serotonergic signalling suppresses ataxin 3 aggregation and neurotoxicity in animal models of Machado-Joseph disease. Brain: A Journal of Neurology. 138, 3221-3237 (2015).
- Joers, J. M., et al. Neurochemical abnormalities in premanifest and early spinocerebellar ataxias. Annals of Neurology. 83 (4), 816-829 (2018).
- Sivitilli, A., Ghiasi, P., Attisano, L. Production of phenotypically uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Bio-protocol. 11 (8), 3985 (2021).
- Sivitilli, A. A., et al. Robust production of uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Life Science Alliance. 3 (5), (2020).
- Camp, J. G., Treutlein, B. Human development: Advances in mini-brain technology. Nature. 545 (7652), 39-40 (2017).
- Giandomenico, S. L., Sutcliffe, M., Lancaster, M. A. Generation and long-term culture of advanced cerebral organoids for studying later stages of neural development. Nature Protocols. 16 (2), 579-602 (2021).
- Yoon, S. J., et al. Reliability of human cortical organoid generation. Nature Methods. 16 (1), 75-78 (2019).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Driehuis, E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Establishment of patient-derived cancer organoids for drug-screening applications. Nature Protocols. 15 (10), 3380-3409 (2020).
