عزل وتحليل الحويصلات خارج الخلية التي يمكن تتبعها والوظيفية من البلازما والأنسجة الصلبة
Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة لاستخراج الحويصلات خارج الخلية من الدم المحيطي والأنسجة الصلبة مع التنميط اللاحق للمستضدات السطحية وشحنات البروتين.
Abstract
تمثل الحويصلات خارج الخلية المنتشرة والمقيمة في الأنسجة (EVs) أهدافا واعدة كمؤشرات حيوية علاجية جديدة ، وتظهر كلاعبين مهمين في الحفاظ على التوازن العضوي وتطور مجموعة واسعة من الأمراض. بينما يركز البحث الحالي على توصيف الإكسوسومات الداخلية ذات الأصل الإندوسومي ، اكتسبت الحويصلات الدقيقة التي تتدفق من غشاء البلازما اهتماما متزايدا في الصحة والمرض ، والتي تتميز بوفرة من الجزيئات السطحية التي تلخص توقيع الغشاء للخلايا الأم. هنا ، يتم تقديم إجراء قابل للتكرار يعتمد على الطرد المركزي التفاضلي لاستخراج وتوصيف المركبات الكهربائية من البلازما والأنسجة الصلبة ، مثل العظام. يصف البروتوكول كذلك التنميط اللاحق للمستضدات السطحية وشحنات البروتين من المركبات الكهربائية ، والتي يمكن تتبعها بالتالي لاشتقاقاتها وتحديدها بمكونات تتعلق بالوظيفة المحتملة. ستكون هذه الطريقة مفيدة للتحليل الترابطي والوظيفي والميكانيكي للمركبات الكهربائية في الدراسات البيولوجية والفسيولوجية والمرضية.
Introduction
تم اقتراح الحويصلات خارج الخلية (EVs) لتحديد الهياكل خارج الخلية المغلقة بطبقة ثنائية من الدهون1 ، والتي تلعب أدوارا مهمة في مختلف الأحداث الفسيولوجية والمرضية2. يمكن تقسيم EVs التي تطلقها الخلايا السليمة على نطاق واسع إلى فئتين رئيسيتين ، وهما exosomes (أو EVs الصغيرة) التي تشكلت من خلال مسار الاتجار داخل الخلايا3 والحويصلات الدقيقة (أو EVs الكبيرة) التي طورها التبرعم الخارجي لغشاء البلازماللخلية 4. بينما تركز العديد من الدراسات على وظيفة EVs التي تم جمعها من الخلايا المستزرعة في المختبر5 ، فإن EVs المشتقة من الدورة الدموية أو الأنسجة أكثر تعقيدا وغير متجانسة ، والتي لها ميزة تعكس الحالة الحقيقية للكائن الحي في الجسم الحي6. علاوة على ذلك ، يمكن لجميع أنواع الأنسجة تقريبا إنتاج EVs في الجسم الحي ، ويمكن أن تعمل هذه المركبات الكهربائية كرسائل داخل الأنسجة أو يتم نقلها بواسطة سوائل الجسم المختلفة ، وخاصة الدم المحيطي ، لتسهيل الاتصال الجهازي7. EVs في الدورة الدموية والأنسجة هي أيضا أهداف لتشخيص الأمراض وعلاجها8.
في حين تمت دراسة الإكسوسومات بشكل مكثف في السنوات الأخيرة ، فإن الحويصلات الدقيقة لها أيضا وظائف بيولوجية مهمة ، والتي يمكن استخراجها بسهولة دون الطرد المركزي الفائق ، وبالتالي تعزيز البحوث الأساسية والسريرية9. والجدير بالذكر أن القضية الحرجة المتعلقة بالمركبات الكهربائية المعزولة من الدورة الدموية والأنسجة هي أنها مشتقة من أنواع مختلفة من الخلايا10. نظرا لأن الحويصلات الدقيقة يتم نفخها من غشاء البلازما وتتميز بوفرة من جزيئات سطح الخلية9 ، فإن استخدام علامات غشاء الخلية الأم لتحديد الأصل الخلوي لهذه المركبات الكهربائية أمر ممكن. على وجه التحديد ، يمكن تطبيق تقنية قياس التدفق الخلوي (FC) للكشف عن علامات الغشاء. علاوة على ذلك ، يمكن للباحثين عزل المركبات الكهربائية وإجراء مزيد من التحليلات بناء على الشحنات الوظيفية.
يوفر البروتوكول الحالي إجراء شاملا لاستخراج وتوصيف المركبات الكهربائية من عينات الجسم الحي. يتم عزل المركبات الكهربائية عن طريق الطرد المركزي التفاضلي ، ويشمل توصيف المركبات الكهربائية التحديد المورفولوجي عبر تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) والمجهر الإلكتروني النافذ (TEM) ، وتحليل الأصل عبر FC ، وتحليل شحنة البروتين عبر اللطخة الغربية. يتم استخدام بلازما الدم وعظم الفك العلوي للفئران كممثلين. يمكن للباحثين الرجوع إلى هذا البروتوكول للمركبات الكهربائية من مصادر أخرى وإجراء التعديلات المقابلة.
Protocol
Representative Results
Discussion
عند دراسة ميزات ومصير ووظيفة المركبات الكهربائية ، من الضروري عزل المركبات الكهربائية ذات العائد العالي والتلوث المنخفض. توجد طرق مختلفة لاستخراج المركبات الكهربائية ، مثل الطرد المركزي المتدرج الكثافة (DGC) ، وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) ، ومقايسات التقاط المناعة 4,20</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل بمنح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32000974 و 81870796 و 82170988 و 81930025) ومؤسسة علوم ما بعد الدكتوراه الصينية (2019M663986 و BX20190380). نحن ممتنون للمساعدة التي قدمها المركز الوطني التجريبي للتدريس التجريبي للطب الأساسي (AMFU).
Materials
| 4% paraformaldehyde | Biosharp | 143174 | Transmission electron microscope |
| Alexa fluor 488 anti-goat secondary antibody | Yeason | 34306ES60 | Flow cytometry |
| Alexa fluor 488 anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen | A11008 | Flow cytometry |
| Anti-CD18 antibody | Abcam | ab131044 | Flow cytometry |
| Anti-CD81 antibody | Abcam | ab109201 | Western blot |
| anti-CD9 antibody | Huabio | ET1601-9 | Western blot |
| Anti-Mitofilin antibody | Abcam | ab110329 | Western blot |
| APOA1 Rabbit pAb | Abclone | A14211 | Western blot |
| BCA protein assay kit | TIANGEN | PA115 | Western blot |
| BLUeye Prestained Protein Ladder | Sigma-Aldrich | 94964-500UL | Western blot |
| Bovine serum albumin | MP Biomedical | 218072801 | Western blot |
| Caveolin-1 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53564 | Western blot |
| CellMask Orange plasma membrane stain | Invitrogen | C10045 | Flow cytometry |
| Chemiluminescence | Amersham Biosciences | N/A | Western blot |
| Curved operating scissor | JZ Surgical Instrument | J21040 | EV isolation |
| Electronic balance | Zhi Ke | ZK-DST | EV isolation |
| Epoch spectrophotometer | BioTek | N/A | Western blot |
| Eppendorf tubes | Eppendorf | 3810X | EV isolation |
| Flotillin-1 antibody | PTM BIO | PTM-5369 | Western blot |
| Gel imaging system | Tanon | 4600 | Western blot |
| Golgin84 | Novus | nbp1-83352 | Western blot |
| Grids – Formvar/Carbon Coated – Copper 200 mesh | Polysciences | 24915 | Transmission electron microscope |
| Heparin Solution | StemCell | 7980 | EV isolation |
| Liberase Research Grade | Sigma-Aldrich | 5401127001 | EV isolation |
| Microscopic tweezer | JZ Surgical Instrument | JD1020 | EV isolation |
| NovoCyte flow cytometer | ACEA | N/A | Flow cytometry |
| Omni-PAGE Hepes-Tris Gels Hepes 4~20%, 10 wells | Epizyme | LK206 | Western blot |
| OSCAR(D-19) antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-34235 | Flow cytometry |
| PBS (2x) | ZHHC | PW013 | Western blot |
| Pentobarbital sodium | Sigma-Aldrich | 57-33-0 | Anesthetization |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jacson | 115-035-003 | Western blot |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jacson | 111-035-003 | Western blot |
| Phosphotungstic acid | RHAWN | 12501-23-4 | Transmission electron microscope |
| PKM2(d78a4) xp rabbit mab | Cell Signaling | 4053t | Western blot |
| Polyethylene (PE) film | Xiang yi | 200150055 | Transmission electron microscope |
| Polyvinylidene fluoride membranes | Roche | 3010040001 | Western blot |
| Protease inhibitors | Roche | 4693132001 | Western blot |
| Recombinant anti-PGD antibody | Abcam | ab129199 | Western blot |
| RIPA lysis buffer | Beyotime | P0013 | Western blot |
| SDS-PAGE loading buffer (5x) | Cwbio | CW0027S | Western blot |
| Size beads | Invitrogen | F13839 | Flow cytometry |
| Tabletop High-Speed Micro Centrifuges | Hitachi | CT15E | EV isolation |
| Transmission electron microscope | HITACHI | H-7650 | Transmission electron microscope |
| Tween-20 | MP Biomedicals | 19472 | Western blot |
| Vortex Mixer Genie | Scientific Industries | SI0425 | EV isolation |
| ZetaView BASIC NTA – Nanoparticle Tracking Video Microscope PMX-120 | Particle Metrix | N/A | Nanoparticle tracking analysis |
| α-Actinin-4 Rabbit mAb | Abclone | A3379 | Western blot |
| β-actin | Cwbio | CW0096M | Western blot |
References
- Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to extracellular vesicles: biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake. Cellular and Molecular Neurobiology. 36 (3), 301-312 (2016).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
- Van Niel, G., D’Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360 (2013).
- Keshtkar, S., Azarpira, N., Ghahremani, M. H. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: novel frontiers in regenerative medicine. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 63 (2018).
- Thietart, S., Rautou, P. E. Extracellular vesicles as biomarkers in liver diseases: A clinician’s point of view. Journal of Hepatology. 73 (6), 1507-1525 (2020).
- Xia, W., et al. Damaged brain accelerates bone healing by releasing small extracellular vesicles that target osteoprogenitors. Nature Communications. 12 (1), 6043 (2021).
- In’t Veld, S. G. J. G., Wurdinger, T. Tumor-educated pletelets. Blood. 133 (22), 2359-2364 (2019).
- Schwager, S. C., Reinhart-King, C. A. Mechanobiology of microvesicle release, uptake, and microvesicle-mediated activation. Current Topics in Membranes. 86, 255-278 (2020).
- Brahmer, A., et al. endothelial cells and leukocytes contribute to the exercise-triggered release of extracellular vesicles into the circulation. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1615820 (2019).
- Yang, H., et al. Blood collection through subclavian vein puncture in mice. Journal of Visualized Experiments. (147), e59556 (2019).
- Han, L., Lam, E. W., Sun, Y. Extracellular vesicles in the tumor microenvironment: old stories, but new tales. Molecular Cancer. 18 (1), 59 (2019).
- Gelibter, S., et al. The impact of storage on extracellular vesicles: A systematic study. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12162 (2022).
- Forsyth, C. B., Mathews, H. L. Lymphocytes utilize CD11b/CD18 for adhesion to Candida albicans. Cellular Immunology. 170 (1), 91-100 (1996).
- Kodama, J., Kaito, T. Osteoclast multinucleation: review of current literature. International Journal of Molecular Sciences. 21 (16), 5685 (2020).
- Welsh, J. A., et al. MIFlowCyt-EV: a framework for standardized reporting of extracellular vesicle flow cytometry experiments. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1713526 (2020).
- Durcin, M., et al. Characterisation of adipocyte-derived extracellular vesicle subtypes identifies distinct protein and lipid signatures for large and small extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1305677 (2017).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 968-977 (2016).
- Noren Hooten, N., et al. Association of extracellular vesicle protein cargo with race and clinical markers of mortality. Scientific Reports. 9 (1), 17582 (2019).
- Sidhom, K., Obi, P. O., Saleem, A. A review of exosomal isolation methods: is size exclusion chromatography the best option. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6466 (2020).
- Pietrowska, M., Wlosowicz, A., Gawin, M., Widlak, P. MS-based proteomic analysis of serum and plasma: problem of high abundant components and lights and shadows of albumin removal. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1073, 57-76 (2019).
- Coumans, F., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360 (2013).
- Coumans, F., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).
- Görgens, A., et al. Identification of storage conditions stabilizing extracellular vesicles preparations. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (6), 12238 (2020).
- Maroto, R., et al. Effects of storage temperature on airway exosome integrity for diagnostic and functional analyses. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1359478 (2017).
- Zheng, C., et al. Apoptotic vesicles restore liver macrophage homeostasis to counteract type 2 diabetes. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (7), 12109 (2021).
- Liu, D., et al. Circulating apoptotic bodies maintain mesenchymal stem cell homeostasis and ameliorate osteopenia via transferring multiple cellular factors. Cell Research. 28 (9), 918-933 (2018).
- Vander Pol, E., van Gemert, M. J., Sturk, A., Nieuwland, R., van Leeuwen, T. G. Single vs. swarm detection of microparticles and exosomes by flow cytometry. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 10 (5), 919-930 (2012).
- Dawson, G. Isolation of lipid rafts (detergent-resistant microdomains) and comparison to extracellular vesicles (exosomes). Methods in Molecular Biology. 2187, 99-112 (2021).
- Zhang, G., et al. Extracellular vesicles: Natural liver-accumulating drug delivery vehicles for the treatment of liver diseases. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (2), 12030 (2020).
- Vella, L. J., et al. A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1348885 (2017).
