체외 괴사성 장염의 Apical-Out Enteroid 모델

Summary

이 프로토콜은 극성이 역인 작은 장 장내염을 활용하여 정점 표면에 접근 할 수있는 apical-out 괴사 장염 (NEC) 인 – 접시 모델을 설명합니다. 우리는 NEC 관련 상피 파괴를 검출하기위한 면역 형광 염색 프로토콜 및 NEC-in-a-dish 프로토콜을 실시한 apical-out enteroids의 생존력을 결정하는 방법을 제공합니다.

Abstract

괴사 성 장염 (NEC)은 장내 염증과 괴사를 특징으로하는 조산아에 영향을 미치는 치명적인 질병입니다. 엔테로이드는 최근 위장 병리를 모델링하는 유망한 시스템으로 부상했습니다. 그러나 현재 사용되는 엔테로이드 조작 방법은 상피의 정점 표면 (3 차원 [3D])에 대한 액세스가 부족하거나 시간이 많이 걸리고 자원 집약적 인 (2 차원 [2D] 단층)입니다. 이러한 방법은 종종 모델이 생리적으로 번역 가능해지기 위해 미세 주입과 같은 추가 단계가 필요합니다. 여기에서, 우리는 장내 극성을 역전시켜 시험관 내에서 NEC를 연구하기위한 생리 학적으로 관련되고 저렴한 프로토콜을 설명하며, 그 결과 정점 표면이 바깥쪽으로 향하게됩니다 (apical-out). 노목스 또는 저산소 조건 하에서 종양 괴사 인자-알파 (TNF-α) 또는 리포폴리사카라이드 (LPS)에 노출된 후 장내 장벽 완전성 및 접합 단백질 발현을 검사하기 위한 면역형광 염색 프로토콜이 또한 제공된다. 24시간 동안 노목성 또는 저산소 LPS 또는 TNF-α에 노출된 3D apical-out enteroids의 생존력도 또한 평가된다. 저산소증과 함께 LPS 또는 TNF-α에 노출된 엔테로이드는 상피 구조의 파괴, 부착물 접합 단백질 발현의 손실 및 세포 생존력의 감소를 나타내었다. 이 프로토콜은 NEC 요법의 잠재적 상피 표적을 식별하고 치료제에 대한 조기 장 반응을 연구하는 생리학적으로 관련되고 비용 효율적인 플랫폼을 제시하는 새로운 apical-out NEC-in-a-dish 모델을 설명합니다.

Introduction

조산아의 최대 10 %에서 발생하는 소장의 심각한 염증성 질환 인 괴사 성 장염 (NEC)은 일반적으로 높은 이환률 및 사망률 ^1,2과 관련이 있습니다. 외과 적 개입이 필요한 매우 낮은 출생 체중 (<1500g) 유아의 사망률이 50 %에 근접하는 것은 드문 일이 아닙니다³. NEC의 정확한 병인은 현재 이해되지 않았지만, 수식 먹이기와 같은 위험 요소는 질병^2,4의 발달에서 dysbiosis^, 미성숙 장 상피 및 기능 장애 장 장벽과 같은 생리 학적 이상을 가진 화합물로 생각됩니다. 상당한 노력에도 불구하고, NEC의 예방 또는 치료에 거의 진전이 없었다 지난 십 년^{동안 5}. NEC 및 관련 장 상피 장벽 기능 장애를 연구하기위한 새로운 시험관 내 방법은 동물 모델의 연구 결과가 지금까지 침대 옆으로 잘못 번역 된 것처럼 질병의 병인에 대한 이해를 증진시키는 데 필요합니다⁶.

다수의 시험관내 모델이 NEC 동안 작용 메카니즘을 조사하기 위해 이용되었다. 인간 장 상피 세포주인 Caco-2는 NEC ^7,8의 시험관내 모델에서 가장 일반적으로 활용되는 모델 중 하나입니다. Caco-2 세포는 소장의 테두리 형태학적 특징을 에뮬레이트하지만, 세포주로서, 점액 생성 잔 세포를 포함하는 매우 다양한 생체내 세포 유형으로 분화되지 않으며, 고도로 번역가능한 모델에 요구된다. HT-29-MTX, 인간 결장 선암종 세포는, 혼합된 장내세포 및 잔 세포 표현형을 포함하지만, 여전히 장내 상피⁹의 크립트계 세포 유형이 결여되어 있다. IEC-6 및 IEC-18은 미성숙 장폐색-유사 형태를 갖는 형질전환되지 않은 세포주이지만, 인간 조직으로부터 유래되지 않으며, 이들의 번역 능력을 제한한다. FHs 74-Int 및 H4 장 세포주는 인간 태아 조직으로부터 유래되고 단단한 접합부 또는 편광 단층^10,11을 형성하지 않으며^, 따라서 NEC에 감수성인 가장 미숙아에 비해 미성숙하다. 전형적으로, 시험관내 NEC 모델은 NEC¹²에서 장 염증을 개시하는 주요 수용체인 톨 유사 수용체 4(TLR4)를 유도하기 위해 리포폴리사카라이드(LPS) 치료법을 이용한다. 반응성 산소 종(ROS) 처리를 통해 매개되는 손상은, 전형적으로 과산화수소를 통해, NEC와 같은 산화적 손상 및 아폽토시스(^{apoptosis)13,14}를 유도하는데 종종 사용된다. 장 염증의 주요 동인으로서, 염증성 TLR4 신호전달의 하류 성분인 종양 괴사 인자-알파(TNF-α)는 또한 생체내 병인⁽¹⁵)을 모방하기 위해 이들 시험관내 모델에서 일반적으로 활용된다.

유도성 만능 줄기 세포 (iPSCs)로부터 생성 된 오가노이드는 이들이 유래 된 조직의 복잡한 생체 내 구조 및 세포 유형 조성을 재구성 할 수있는 능력으로 인해 장의 시험관 내 모델로서 인기를 얻었습니다^16,17. 관련 시험관내 시스템인 엔테로이드는 iPSC 유래 오가노이드보다 더 쉽게 확립되고 유지되는 절제된 장내 크립트로부터 유래된 오가노이드이다. 엔테로이드는 전형적으로 기저측성 세포 표면에 제한된 실험적 접근을 갖는 3차원(3D) 세포외 매트릭스(ECM)에서 성장한다. 미세 주입^18,19와 같은 방법은 정점 표면에 대한 이러한 장벽을 극복하기 위해 개발되었지만 루멘 내에 슬로프 된 세포 파편과 점액이 축적되면 미세 주입이 기술적으로 어렵고 일관성이 없습니다. 맞춤형 로봇 미세 주입 플랫폼이 널리 접근 할 수 없기 때문에²⁰, 기술 능력 및 일반 기술의 실험실 간 변동성은 미세 주입 프로토콜로 극복하기위한 중요한 변수가됩니다. 해리된 3D 엔테로이드로부터 유래된 2차원(2D) 단일층은, 여전히 장 상피의 모든 주요 세포 유형을 포함하며, 정점 표면에 대한 접근을 허용하지만, 전통적으로 중간엽 근섬유아세포(²¹)의 피더층 없이는 유지하기가 어려웠다. 세포 배양 투과성 지지체는 근본적인 근섬유아세포를 사용하지 않고 엔테로이드 단층의 정점 및 기저측 측면 모두에 접근하기 위해 사용될 수 있지만, 이러한 삽입물은 공초점 현미경과 같은 양식과 함께 사용하기 전에 막의 절제 및 장착이 필요하며, 이는 전통적인 현미경 검사법⁽²²)을 사용할 때 기술적으로 더 까다롭고 어려운 과정을 초래한다. NEC는 전통적인 3D 엔테로이드 23,24,25 및 투과성 지지 체 26,27을 사용하여 시험관 내에서 모델링되었으며, 장 염증은 최근 장내 온 칩 모델^28,29로 복제되었습니다. 미세유체학을 통합한 장-온-어-칩 모델은 지금까지 가장 진보되고 번역 가능한 모델이지만, 이 기술은 비싸고, 복잡하며, 대부분의 조사자⁽³⁰)가 접근할 수 없다.

apical-out enteroid 기술의 최근 발전은 시험관내 상피^31,32,33의 구조적 완전성에 대한 손상의 위험없이 3D 엔테로이드의 정점 표면에 더 쉽게 접근 할 수있게했습니다^. Apical-out enteroids는 생체 내 장 상피의 세포 유형 조성 및 장벽 기능을 공유하지만, 일반적인 3D 엔테로이드와 달리 이들 세포의 정점 표면은 배양 배지에 직면하여 영양 흡수, 미생물 감염 및 발광 분비에 대한보다 생리 학적으로 관련된 연구를 가능하게합니다³¹. apical-out enteroids의 추가적인 이점은 실험 제제를 엔테로이드에 균질하게 분배하는 능력이다. 엔테로이드 크기에 기초한 다양한 치료 부피는 미세주입과 마찬가지로 요구되지 않으며, 현탁 배양물에서 이러한 엔테로이드를 유지하는 능력은 실험제 확산(³²)에 대한 임의의 ECM 간섭을 무효화한다.

괴사성 장염은 여러 장 상피 세포 유형 및 다양한 환경 및 병리 생리학적 요인³⁴를 포함하는 다인자 질환이다. 장 장내 장내 세포의 다양한 세포 조성은 NEC와 같은 복잡한 질병을 모델링 할 때 단일 배양에 비해 명확한 개선입니다. 흥미롭게도, 단일 염증 노출이 종종 시험관내 단일배양물에서 손상을 유도하기에 충분한 반면, 엔테로이드는 마우스 모델⁽²³)과 마찬가지로, NEC 유사 손상을 유도하기 위해 최소 두 개의 염증 성분을 필요로 하는 것으로 보인다⁶. 여기에서, 우리는 저산소증 (NEC⁶의 중요한 임상 적 특징) 및 LPS 또는 TNF-α과 함께 apical-out enteroids를 사용하여 NEC와 같은 염증에 대한 상피 반응을 연구하고 잠재적으로 치료 표적을 확인하기 위해 개선 된 생리학 적으로 관련성이 높은 시험관 내 모델로서 apical-out NEC-in-a-dish 모델을 제시합니다. 우리는 소장 3D 엔테로이드의 극성을 역전시키는 프로토콜과 상피 장벽 붕괴 및 접합 단백질 발현 변화를 확인하기위한 면역 형광 염색 프로토콜을 설명합니다. 마지막으로, 우리는 이중 히트, apical-out NEC-in-a-dish 모델의 영향을 결정하기 위해 간단한 엔테로이드 생존력 분석을 추가로 시연합니다.

Protocol

이 연구의 모든 동물 절차는 오클라호마 대학 건강 과학 센터 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 조산 비인간 영장류(NHP, 90% 임신, 올리브 비봉, 파피오 아누비스)로부터의 소장 편의 샘플을 별도의 연구를 위해 안락사 후 수득하였다(프로토콜 #101523-16-039-I). 1. 아피칼 아웃 엔테로이드 NEC-in-a-dish 모델 구축 배지 및 엔테로이드 치료?…

Representative Results

장내 염증을 모델링하기 위해 엔테로이드를 사용하는 것은 괴사 성 장염의 맥락에서도 이제는 일반적입니다. 그러나 현재 사용되는 대부분의 방법은 엔테로이드의 정점 표면에 대한 접근이 부족하여 경구 치료제로 궁극적으로 사용하기위한 화합물의 생리적 관련성을 부정하거나 엔테로이드 유래 단층과 마찬가지로 기술적으로 어렵고 시간이 많이 걸립니다. NEC의 현재 시험관내 엔테로이…

Discussion

장 상피 크립트에서 유래 된 엔테로이드 모델의 최근 개발은 괴사 성 장염 병인을 연구하는보다 생리학적으로 관련된 시험관 내 조직을 허용합니다. 장 상피의 모든 주요 분화된 세포 유형을 포함함에도 불구하고, 3D 엔테로이드는 여전히 몇 가지 중요한 제한의 대상이 된다. 종래의, 기저측성-아웃 엔테로이드는 3D ECM 하이드로겔 돔에 현탁되며, 그 조성 및 밀도는 조직 배양 환경<sup class="xr…

Materials

0.5 M EDTA, pH 8.0	Fisher Scientific	15575-020
1.5 mL microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-408-129
15 mL Conical tube	VWR	89039-666
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay	Promega	G9681
Corning Costar Ultra-Low Attachment 24-Well Microplates	Fisher Scientific	07-200-602
Cover Glass 24 mm x 60 mm	Thermo Scientific	102460
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Scientific	A-21202
Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody, Cy3 conjugate	Sigma-Aldrich	AP182C
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer	STEMCELL Technologies	36254
E-cadherin antibody (7H12)	Novus Biologicals	NBP2-19051
Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9	Millipore Sigma	1004960700
Glycerol	Sigma-Aldrich	56-81-5
ImageJ	Fiji	N/A
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)	STEMCELL Technologies	06010
Leica SP8 Confocal Microscope	Leica Biosystems
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography	Millipore Sigma	L3012-10MG
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-544-7
Normal Donkey Serum	Sigma-Aldrich	566460
Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate	Thermo Scientific	136101
PBS (Phosphate Buffered Saline), 1x [-] calcium, magnesium, pH 7.4	Corning	21-040-CM
Prolong Glass Antifade Mountant with NucBlue	Fisher Scientific	P36983
Recombinant Anti-Villin antibody [SP145]	Abcam	ab130751
Recombinant Human TNF-α protein 100 µg	Bio-Techne	210-TA-100/CF
SpectraMax iD3 Multi-Mode Microplate Reader	Molecular Devices
Thermo Forma Series II Water-Jacketed Tri-Gas Incubator, 184L	Fisher Scientific	3140
TO-PRO-3 Iodide (642/661)	Thermo Scientific	T3605
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1
Tubes, 0.5 mL, flat cap	Thermo Scientific	AB0350
Tween-20	Sigma-Aldrich	9005-64-5