Method Article

COVID-19 관련 중이 병리학 평가를위한 고속 인간 측두골 절편

DOI:

10.3791/64012

⸱

May 18th, 2022

 ,  ,  , 
1Department of Otolaryngology - Head & Neck Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 2W. Harry Feinstone Department of Molecular Microbiology and Immunology, Johns Hopkins University Bloomberg School of Public Health, 3Department of Pathology, Johns Hopkins University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 기사에서는 트윈 다이아몬드 블레이드가있는 마이크로 소를 사용하여 측두골 면역 조직 화학의 신속한 탈석회화 및 분석을 위해 얇은 조각을 생성하는 신속한 인간 측두골 절편 기술을 설명합니다.

Abstract

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인간의 측두골 절편의 조직병리학적 분석은 내이 및 중이 병리학을 연구하기 위한 근본적인 기술이다. 측두골 절편은 사후 측두골 수확, 고정, 탈석회화, 임베딩 및 염색에 의해 준비됩니다. 측두골의 밀도로 인해 탈석회화는 시간이 많이 걸리고 자원 집약적 인 과정입니다. 완전한 조직 준비는 평균 9-10 개월이 걸릴 수 있습니다. 이것은 이비병리학 연구를 늦추고 COVID-19 전염병과 관련된 연구와 같이 시간에 민감한 연구를 방해합니다. 이 논문은 조직 처리 속도를 높이기 위해 측두골 절편의 신속한 준비 및 탈석회화 기술을 설명합니다.

측두골은 표준 기술을 사용하여 사후 수확하고 10% 포르말린으로 고정하였다. 트윈 다이아몬드 블레이드가 달린 정밀 마이크로 톱을 사용하여 각 섹션을 세 개의 두꺼운 섹션으로 절단했습니다. 두꺼운 측두골 절편을 파라핀에 매립하기 전에 7-10일 동안 탈석회화 용액에서 탈석회시키고, 냉동고를 사용하여 얇은 (10 μm) 절편으로 절편화하고, 충전되지 않은 슬라이드에 장착하였다. 이어서, 조직 샘플을 탈파라핀화하고 항체 염색 (ACE2, TMPRSS2, Furin)을 위해 재수화시키고, 이미지화하였다. 이 기술은 수확에서 조직 분석까지의 시간을 9-10 개월에서 10-14 일로 단축했습니다. 고속 측두골 절제술은 이비병리학 연구의 속도를 높이고 조직 준비에 필요한 자원을 줄이는 동시에 COVID-19와 관련된 것과 같은 시간에 민감한 연구를 촉진 할 수 있습니다.

Introduction

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인간의 측두골 연구는 내이와 중이의 병리학 및 병리 생리학을 연구하는 데 귀중한 자원을 제공합니다. 19세기 이전에는 이비인후과 질환 1,2,3에 대해 알려진 바가 거의 없었다. 이비인후과 질환을 더 잘 이해하고 "돌팔이의 손에서 청각 수술을 구하기"위해 Joseph Toynbee (1815-1866)는 인간 측두골의 조직 학적 섹션을 연구하는 방법을 개발했습니다3. 이 연구는 19 세기의 나머지 기간 동안 비엔나와 유럽 전역의 Adam Politzer (1835-1920)에 의해 촉진되었으며, 그는 측두골 섹션을 사용하여 귀 2,3,4에 영향을 미치는 많은 일반적인 조건의 조직 병리학을 설명했습니다.

미국 최초의 인간 측두골 실험실은 1927 년 존스 홉킨스 병원 (Johns Hopkins Hospital)에 문을 열었으며, 스테이시 길드 (Stacy Guild, 18....

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Protocol

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이 프로토콜은 IRB (IRB00250002) 승인과 인간 조직 및 감염성 물질의 사용에 대한 제도적 정책에 따라 개발되었습니다. 각 측두골 기증자는 사망 전에 서면 동의를 제공했거나 기증자의 가족으로부터 사후 동의를 얻었습니다. 이 프로토콜에 사용되는 모든 재료, 장비 및 소프트웨어에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.

1. 측두골 수확

  1. 이 프로토콜을 활용하기 전에 지역 기관 검토 위원회 (IRB) 이사회 승인을 받고, 인간 및 전염성 물질 사용에 대한 제도적 정책을 검토하고, 조직 기증에 대한 동의를 얻으십시오.
  2. COVID-19 양성 측두골 기증자의 조직으로 작업하기 전에 적절한 개인 보호 장비 (PPE)를 착용하십시오. PPE가 N-95 인공 호흡기와 안면 보호막(또는 양압 공기 정화 시스템), 가운 및 두 쌍의 장갑으로 구성되어 있는지 확인하십시오. 이 프로토콜10을 시작하기 전에 PPE를 적절하게 기부하고 도핑하는 기술을 검토하십시오.
  3. 기증자 사망 후 12-24 시간 이내에 측두골 조직을 수확하십시오. 시체가 냉장 보관되지 않은 경우 사망 후 8 시간 이내에 수확이 이루....

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Results

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중이 점막 및 유스타키오관의 헤마톡실린 및 에오신 염색은 처리 후 중이 점막 및 중이 조직의 보존을 나타내었다(도 1). 면역조직화학 이미지는 중이 점막 및 유스타키오관 내에서 ACE2, TMPRSS2, 및 퓨린 단백질의 발현을 보여주었다(도 1). 중이 내에 이러한 단백질의 존재는 SARS-CoV-2가 중이 내의 호흡기 상피를 감염시킬 수있는 가능한 경로를 제공합니다11,12,13. 또한, 유스타키오관 내에서 이러한 단백질의 발현은 바이러스가 중이에 들어가고, 유스타키오관을 통해 비인두로부터 중이로 이동하는 경로를 설명할 수 있다.

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Discussion

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인간의 측두골 연구는 내과 중이 병리학을 연구하는 데 중요하지만 시간과 자원 집약적 인 노력으로 남아 있습니다. 이 논문은 다이아몬드 마이크로 톱을 사용하여 추가 절편화 전에 신속하게 탈석회화 할 수있는 두꺼운 측두골 절편을 생성하여 조직 수확에서 연구까지의 시간을 9-10 개월에서 10-14 일로 단축 할 수있는 기술을 설명합니다. 이 기술은 측두골 처리에 필요한 자원을 줄이고 COVID-19 중이 및 내이 병리학(13)과 관련된 것과 같은 시간에 민감한 연구를 촉진 할 수 있으며,이 프로토콜을 개발하기위한 동기였습니다. 이 프로토콜은 중이 및 유스타키오 관 내에서 ACE2, TMPRS22 및 Furin 발현의 시각화를 허용하여 SARS-CoV-2가 비인두에서 유스타키오 관을 통해 확산되어 중이를 감염시킬 수있는 메커니즘을 제공했습니다.

이 프로토콜의 주요 혁신은 탈석회화 전에 조직을 절단하는 다이아몬드 톱의 사용이며, 이는 탈석회화제.......

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Disclosures

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저자는 선언 할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로젝트에 도움을 주신 모하메드 리하르에게 감사드립니다. 이 연구는 부분적으로 국립 보건원 (T32DC000027, NSA)에 의해 지원되었습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-ACE-2 항체 (1:50 희석)Novus BiologicalsSN0754
Anti-Furin 항체 (1:250 희석)AbcamEPR 14674
Anti-TMPRSS2 항체 (1:1,000 희석)Novus BiologicalsNBP1-20984
BX43 수동 시스템 현미경Olympus Life Science Solutions
CBN/Diamond Hybrid 웨이퍼링 BladePace TechnologiesWB-007GP
Collin Mallet - 8''Surgical MartSM1517
DS-Fi3 현미경 카메라Nikon
Dual Endogenous Enzyme Block (상업용 차단 솔루션)DakoS2003
Eaosin StainSigma-Aldrich548-24-3
포르말린 용액, 중성 완충된 10%Sigma-AldrichHT501128
Formical-4 Decalcifier (포름산 석회질 제거 용액)StatLab1214-1 GAL
Hematoxylin StainSigma-AldrichH9627
HRP-Conjugated Anti-Rabbit Secondary Antibody (1:100 dilution)Leica BiosystemsPV6119
ImmPRESS HRP Horse Anti-Goat igG Detection Kit, Peroxidase (1:100 희석)Vector LaboratoriesMP-7405
Lambotte OsteotomeSurgical MartSM1553
Metallographic PICO 155P Precision SawPace TechnologiesPICO 155Pmicrosaw
NIS Elements 소프트웨어 버전 4.6Nikon
Paraplast PlusSigma-AldrichP3683파라핀
백색 젖빛 끝이 있는 양전하 현미경 슬라이드Walter 제품1140B15
Thermo Shandon Crytome FSE 저온 유지 장치 MicrotomeNew Life Scientific Inc.A78900104cryotome
Triology Pretreatment Solution (상용 전처리 솔루션)Sigma-Aldrich920P-05
XyleneSigma-Aldrich920P-05

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nogueira, J. F., et al. A brief history of otorhinolaryngology: Otology, laryngology and rhinology. Brazilian Journal of Otorhinolaryngology. 73 (5), 693-703 (2007).
  2. Pappas, D. G. Otology through the ages. Otolaryngology-Head and Neck Surgery

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