이 기사에서는 트윈 다이아몬드 블레이드가있는 마이크로 소를 사용하여 측두골 면역 조직 화학의 신속한 탈석회화 및 분석을 위해 얇은 조각을 생성하는 신속한 인간 측두골 절편 기술을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
인간의 측두골 절편의 조직병리학적 분석은 내이 및 중이 병리학을 연구하기 위한 근본적인 기술이다. 측두골 절편은 사후 측두골 수확, 고정, 탈석회화, 임베딩 및 염색에 의해 준비됩니다. 측두골의 밀도로 인해 탈석회화는 시간이 많이 걸리고 자원 집약적 인 과정입니다. 완전한 조직 준비는 평균 9-10 개월이 걸릴 수 있습니다. 이것은 이비병리학 연구를 늦추고 COVID-19 전염병과 관련된 연구와 같이 시간에 민감한 연구를 방해합니다. 이 논문은 조직 처리 속도를 높이기 위해 측두골 절편의 신속한 준비 및 탈석회화 기술을 설명합니다.
측두골은 표준 기술을 사용하여 사후 수확하고 10% 포르말린으로 고정하였다. 트윈 다이아몬드 블레이드가 달린 정밀 마이크로 톱을 사용하여 각 섹션을 세 개의 두꺼운 섹션으로 절단했습니다. 두꺼운 측두골 절편을 파라핀에 매립하기 전에 7-10일 동안 탈석회화 용액에서 탈석회시키고, 냉동고를 사용하여 얇은 (10 μm) 절편으로 절편화하고, 충전되지 않은 슬라이드에 장착하였다. 이어서, 조직 샘플을 탈파라핀화하고 항체 염색 (ACE2, TMPRSS2, Furin)을 위해 재수화시키고, 이미지화하였다. 이 기술은 수확에서 조직 분석까지의 시간을 9-10 개월에서 10-14 일로 단축했습니다. 고속 측두골 절제술은 이비병리학 연구의 속도를 높이고 조직 준비에 필요한 자원을 줄이는 동시에 COVID-19와 관련된 것과 같은 시간에 민감한 연구를 촉진 할 수 있습니다.
서론
인간의 측두골 연구는 내이와 중이의 병리학 및 병리 생리학을 연구하는 데 귀중한 자원을 제공합니다. 19세기 이전에는 이비인후과 질환 1,2,3에 대해 알려진 바가 거의 없었다. 이비인후과 질환을 더 잘 이해하고 "돌팔이의 손에서 청각 수술을 구하기"위해 Joseph Toynbee (1815-1866)는 인간 측두골의 조직 학적 섹션을 연구하는 방법을 개발했습니다3. 이 연구는 19 세기의 나머지 기간 동안 비엔나와 유럽 전역의 Adam Politzer (1835-1920)에 의해 촉진되었으며, 그는 측두골 섹션을 사용하여 귀 2,3,4에 영향을 미치는 많은 일반적인 조건의 조직 병리학을 설명했습니다.
미국 최초의 인간 측두골 실험실은 1927 년 존스 홉킨스 병원 (Johns Hopkins Hospital)에 문을 열었으며, 스테이시 길드 (Stacy Guild, 18....
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프로토콜
이 프로토콜은 IRB (IRB00250002) 승인과 인간 조직 및 감염성 물질의 사용에 대한 제도적 정책에 따라 개발되었습니다. 각 측두골 기증자는 사망 전에 서면 동의를 제공했거나 기증자의 가족으로부터 사후 동의를 얻었습니다. 이 프로토콜에 사용되는 모든 재료, 장비 및 소프트웨어에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
1. 측두골 수확
- 이 프로토콜을 활용하기 전에 지역 기관 검토 위원회 (IRB) 이사회 승인을 받고, 인간 및 전염성 물질 사용에 대한 제도적 정책을 검토하고, 조직 기증에 대한 동의를 얻으십시오.
- COVID-19 양성 측두골 기증자의 조직으로 작업하기 전에 적절한 개인 보호 장비 (PPE)를 착용하십시오. PPE가 N-95 인공 호흡기와 안면 보호막(또는 양압 공기 정화 시스템), 가운 및 두 쌍의 장갑으로 구성되어 있는지 확인하십시오. 이 프로토콜10을 시작하기 전에 PPE를 적절하게 기부하고 도핑하는 기술을 검토하십시오.
- 기증자 사망 후 12-24 시간 이내에 측두골 조직을 수확하십시오. 시체가 냉장 보관되지 않은 경우 사망 후 8 시간 이내에 수확이 이루....
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결과
중이 점막 및 유스타키오관의 헤마톡실린 및 에오신 염색은 처리 후 중이 점막 및 중이 조직의 보존을 나타내었다(도 1). 면역조직화학 이미지는 중이 점막 및 유스타키오관 내에서 ACE2, TMPRSS2, 및 퓨린 단백질의 발현을 보여주었다(도 1). 중이 내에 이러한 단백질의 존재는 SARS-CoV-2가 중이 내의 호흡기 상피를 감염시킬 수있는 가능한 경로를 제공합니다11,12,13. 또한, 유스타키오관 내에서 이러한 단백질의 발현은 바이러스가 중이에 들어가고, 유스타키오관을 통해 비인두로부터 중이로 이동하는 경로를 설명할 수 있다.
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토론
인간의 측두골 연구는 내과 중이 병리학을 연구하는 데 중요하지만 시간과 자원 집약적 인 노력으로 남아 있습니다. 이 논문은 다이아몬드 마이크로 톱을 사용하여 추가 절편화 전에 신속하게 탈석회화 할 수있는 두꺼운 측두골 절편을 생성하여 조직 수확에서 연구까지의 시간을 9-10 개월에서 10-14 일로 단축 할 수있는 기술을 설명합니다. 이 기술은 측두골 처리에 필요한 자원을 줄이고 COVID-19 중이 및 내이 병리학(13)과 관련된 것과 같은 시간에 민감한 연구를 촉진 할 수 있으며,이 프로토콜을 개발하기위한 동기였습니다. 이 프로토콜은 중이 및 유스타키오 관 내에서 ACE2, TMPRS22 및 Furin 발현의 시각화를 허용하여 SARS-CoV-2가 비인두에서 유스타키오 관을 통해 확산되어 중이를 감염시킬 수있는 메커니즘을 제공했습니다.
이 프로토콜의 주요 혁신은 탈석회화 전에 조직을 절단하는 다이아몬드 톱의 사용이며, 이는 탈석회화제.......
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공개 사항
저자는 선언 할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 프로젝트에 도움을 주신 모하메드 리하르에게 감사드립니다. 이 연구는 부분적으로 국립 보건원 (T32DC000027, NSA)에 의해 지원되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Anti-ACE-2 항체 (1:50 희석) | Novus Biologicals | SN0754 | |
| Anti-Furin 항체 (1:250 희석) | Abcam | EPR 14674 | |
| Anti-TMPRSS2 항체 (1:1,000 희석) | Novus Biologicals | NBP1-20984 | |
| BX43 수동 시스템 현미경 | Olympus Life Science Solutions | ||
| CBN/Diamond Hybrid 웨이퍼링 Blade | Pace Technologies | WB-007GP | |
| Collin Mallet - 8'' | Surgical Mart | SM1517 | |
| DS-Fi3 현미경 카메라 | Nikon | ||
| Dual Endogenous Enzyme Block (상업용 차단 솔루션) | Dako | S2003 | |
| Eaosin Stain | Sigma-Aldrich | 548-24-3 | |
| 포르말린 용액, 중성 완충된 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Formical-4 Decalcifier (포름산 석회질 제거 용액) | StatLab | 1214-1 GAL | |
| Hematoxylin Stain | Sigma-Aldrich | H9627 | |
| HRP-Conjugated Anti-Rabbit Secondary Antibody (1:100 dilution) | Leica Biosystems | PV6119 | |
| ImmPRESS HRP Horse Anti-Goat igG Detection Kit, Peroxidase (1:100 희석) | Vector Laboratories | MP-7405 | |
| Lambotte Osteotome | Surgical Mart | SM1553 | |
| Metallographic PICO 155P Precision Saw | Pace Technologies | PICO 155P | microsaw |
| NIS Elements 소프트웨어 버전 4.6 | Nikon | ||
| Paraplast Plus | Sigma-Aldrich | P3683 | 파라핀 |
| 백색 젖빛 끝이 있는 양전하 현미경 슬라이드 | Walter 제품 | 1140B15 | |
| Thermo Shandon Crytome FSE 저온 유지 장치 Microtome | New Life Scientific Inc. | A78900104 | cryotome |
| Triology Pretreatment Solution (상용 전처리 솔루션) | Sigma-Aldrich | 920P-05 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 920P-05 |
참고문헌
- Nogueira, J. F., et al. A brief history of otorhinolaryngology: Otology, laryngology and rhinology. Brazilian Journal of Otorhinolaryngology. 73 (5), 693-703 (2007).
- Pappas, D. G. Otology through the ages. Otolaryngology-Head and Neck Surgery
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재인쇄 및 허가
