Когерентная антистоковская рамановская спектроскопия (CARS) для визуализации миелинизации в срезах мозга
Summary
Визуализация миелинизации является важной целью для многих исследователей, изучающих нервную систему. CARS – это метод, совместимый с иммунофлуоресценцией, который может нативно отображать липиды в ткани, такой как мозг, освещая специализированные структуры, такие как миелин.
Abstract
Когерентная антистоковская рамановская спектроскопия (CARS) — это метод, классически используемый химиками и физиками для получения когерентного сигнала сигнатурных колебаний молекул. Тем не менее, эти вибрационные сигнатуры также характерны для молекул в анатомической ткани, такой как мозг, что делает его все более полезным и применимым для приложений нейробиологии. Например, CARS может измерять липиды, специфически возбуждая химические связи внутри этих молекул, что позволяет количественно оценивать различные аспекты ткани, такие как миелин, участвующий в нейротрансмиссии. Кроме того, по сравнению с другими методами, обычно используемыми для количественной оценки миелина, CARS также могут быть настроены на совместимость с иммунофлуоресцентными методами, что позволяет совместно маркировать с другими маркерами, такими как натриевые каналы или другие компоненты синаптической передачи. Изменения миелинизации являются по своей сути важным механизмом при демиелинизирующих заболеваниях, таких как рассеянный склероз или другие неврологические состояния, такие как синдром хрупкой Х или расстройства аутистического спектра. В заключение, CARS может быть использован инновационными способами, чтобы ответить на насущные вопросы в неврологии и предоставить доказательства основных механизмов, связанных со многими различными неврологическими состояниями.
Introduction
Потенциалы действия являются основной единицей информации в мозге, а распространение потенциала действия через аксоны образует один столп обработки информации 1,2,3. Нейроны обычно получают афферентные входы от нескольких других нейронов и интегрируют эти входы в заданное узкое временноеокно 4,5. Поэтому механизмам распространения потенциала действия в аксонах было уделено значительное внимание со стороны исследователей.
При распространении через аксон потенциал действия многократно регенерируется вдоль аксона для обеспечения надежного распространения6. В большинстве нейронов челюстных позвоночных (гнатостомов) аксоны окружены оболочкой миелина, который представляет собой богатое липидами вещество, продуцируемое близлежащими олигодендроцитами или шванновскими клетками, которые являются типами глиальных клеток (рассмотрено в 7,8). Эта миелиновая оболочка электрически изолирует аксон, уменьшая его емкость и позволяя распространять потенциал действия эффективно, быстро и с более низким потреблением энергии. Миелин не покрывает аксон равномерно, но он обшивает аксон сегментами, которые имеют короткие промежутки между ними, называемые узлами Ранвье (рассмотрено в 9,10). На скорость распространения потенциала действия влияет как толщина миелинизации, контролирующая уровень электрической изоляции аксона, так и расстояние между узлами Ранвье, управляющими частотой, с которой регенерируются потенциалыдействия вдоль аксона.
Существует большое количество литературы, предполагающей, что толщина миелинизации влияет на скорость распространения потенциала действия в аксонах 12,13,14. Кроме того, изменения в миелинизации аксонов могут привести к ряду дефицитов ЦНС 15,16,17,18,19,20,21. Поэтому неудивительно, что многие исследовательские усилия сосредоточены на измерении и характеристике миелинизации аксонов. Измерения толщины миелина чаще всего проводились с помощью электронной микроскопии, метода, который требует значительного количества подготовки тканей и сложен в использовании в сочетании с иммуногистохимией. Тем не менее, существует также более быстрый и простой метод измерения миелинизации аксонов, который основан на когерентной рамановской спектроскопии Против Стокса (CARS). Лазер CARS может быть настроен на различные частоты, и при настройке на частоты, которые подходят для возбуждения липидов, миелин может быть визуализирован без необходимости каких-либо дополнительных меток22. Липидная визуализация может быть объединена со стандартной иммуногистохимией таким образом, что липиды могут быть изображены вместе с несколькими флуоресцентными каналами23. Визуализация миелинизации с помощью CARS значительно быстрее, чем электронная микроскопия, и имеет разрешение, которое, хотя и ниже ЭМ, достаточно для обнаружения даже небольших различий в миелинизации в одном и том же типе аксонов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Растущая литература подчеркивает роль миелина в функции мозга 13,16,21,28. Кроме того, мы знаем, что толщина миелинизации и картина миелинизации могут изменяться при нескольких неврологических состояниях, таких как расс?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Поддерживается NIH R01 DC 17924, R01 DC 18401 (Klug) и NIH 1R15HD105231-01, T32DC012280 и FRAXA (McCullagh). Визуализация CARS была выполнена в основной части Advanced Light Microscopy Центра нейротехнологий в Медицинском кампусе Университета Колорадо Аншутц при частичной поддержке NIH P30 NS048154 и NIH P30 DK116073.
Materials
| Anesthetic: | |||
| 1 mL disposable syringe with needle 27 GA x 0.5" | Exel int | 260040 | |
| Fatal + | Vortech | ||
| Surgery: | |||
| Spring Scissors – 8mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Standard tweezers | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Perfusion: | |||
| 4% Paraformaldehyde | Fisher Chemical | SF994 (CS) | |
| Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14063-11 | |
| Kelly hemostats | Fine Science Tools | 13019-14 | |
| Millipore H2O | |||
| Needle tip, 23 GA x 1" | BD precision glide | 305193 | |
| Phosphate buffered saline (PBS): | |||
| Potassium chloride | Sigma | P9333 | |
| Potassium phosphate monobase | Sigma | P5655 | |
| pump with variable flow or equivalent | |||
| Sodium chloride | Fisher Chemical | s271-1 | |
| Sodiumphosphate dibasic | Sigma | S7907 | |
| Dissection: | |||
| 50 mL vial with 4% PFA | |||
| Bochem Chemical Spoon 180mm | Bochem | 230331000 | |
| Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14063-11 | |
| Noyes Spring Scissors | Fine Science Tools | 15011-12 | |
| Pair of fine (Graefe) tweezers | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Shallow glass or plastic tray, approximately 10" x 10" | |||
| Standard tweezers | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Surgical Scissors – Blunt | Fine Science Tools | 14000-20 | |
| Slicing: | |||
| Agar, plant | RPI | 9002-18-0 | |
| Vibratome | Leica | VT1000s | |
| well plate | Alkali Sci. | TPN1048-NT | |
| Staining: | |||
| AB Media: | 1n 1,000 mL of Millipore H2O | ||
| Phosphate buffered (PB): | |||
| Potassium Phosphate Monobase | Sigma | P5655 | |
| Sodium Phosohate Dibasic | Sigma | S7907 | |
| BSA (Bovine serum albumin) | Sigma life science | A2153-100g | |
| Sodium Chloride | Fisher Chemical | s271-1 | |
| Triton X-100 | Sigma – Aldrich | x100-500ml | |
| Nissl 435/455 | Invitrogen | N21479 | |
| CARS: | |||
| APE picoemerald laser | Angewandte Physik & Elektronik GmbH | ||
| bandpass filter (420-520 nm) | Chroma Technology | HQ470/100m-2P | |
| bandpass filter (500-530 nm) | Chroma Technology | HQ515/30m-2P | |
| bandpass filters (640-680 nm) | Chroma Technology | HQ660/40m-2P | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Cut Transfer pipet | Fisher | 13-711-7M | |
| dichroic longpass 565 nm | Chroma Technology | 565dcxr | |
| dichroic longpass 585 nm | Chroma Technology | 585dcxr | |
| dichroic shortpass 750 nm | Chroma Technology | T750spxrxt | |
| glass bottom culture dish | MatTek | P35G-0-10-C | |
| glass weight (10 mm x 10 mm boro rod) | Allen Scientific Glass Inc | ||
| multiphoton shortpass emission filter 680 nm | Chroma Technology | ET680sp-2p8 | |
| PBS |
References
- Cole, K., Curtis, H. Electric impedance of the squid giant axon during activity. The Journal of General Physiology. 22 (5), 649-670 (1939).
- Cole, K. S., Curtis, H. J. Membrane potential of the squid giant axon during current flow. Journal of General Physiology. 24 (4), 551-563 (1941).
- Alcami, P., El Hady, A. Axonal computations. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 413 (2019).
- Neumann, E., Nachmansohn, D. Nerve excitability-Toward an integrating concept. Aharon Katzir Memorial Volume. , 99-166 (1975).
- Waxman, S. G. Integrative properties and design principles of axons. International Review of Neurobiology. 18, 1-40 (1975).
- Fitzhugh, R. Computation of impulse initiation and saltatory conduction in a myelinated nerve fiber. Biophysical Journal. 2 (1), 11-21 (1962).
- Zalc, B. The acquisition of myelin: a success story. Novartis Foundation Symposium. 276, 275-281 (2006).
- Salzer, J. L., Zalc, B. Myelination. Current Biology. 26 (20), 971-975 (2016).
- Boullerne, A. I. The history of myelin. Experimental Neurology. 283, 431-445 (2016).
- Kuhn, S., Gritti, L., Crooks, D., Dombrowski, Y. Oligodendrocytes in development, myelin generation and beyond. Cells. 8 (11), 1424 (2019).
- Saab, A. S., Nave, K. -. A. Myelin dynamics: protecting and shaping neuronal functions. Current Opinion in Neurobiology. 47, 104-112 (2017).
- Chomiak, T., Hu, B. What is the optimal value of the g-Ratio for myelinated fibers in the rat CNS? A theoretical approach. PLOS ONE. 4 (11), 7754 (2009).
- Ford, M. C., et al. Tuning of Ranvier node and internode properties in myelinated axons to adjust action potential timing. Nature Communications. 6, 8073 (2015).
- Stange-Marten, A., et al. Input timing for spatial processing is precisely tuned via constant synaptic delays and myelination patterns in the auditory brainstem. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (24), 4851-4858 (2017).
- Bu, J., Banki, A., Wu, Q., Nishiyama, A. Increased NG2+ glial cell proliferation and oligodendrocyte generation in the hypomyelinating mutant shiverer. Glia. 48 (1), 51-63 (2004).
- Pacey, L. K. K., et al. Delayed myelination in a mouse model of fragile X syndrome. Human Molecular Genetics. 22 (19), 3920-3930 (2013).
- Green, A. J., et al. Clemastine fumarate as a remyelinating therapy for multiple sclerosis (ReBUILD): a randomised, controlled, double-blind, crossover trial. Lancet. 390 (10111), 2481-2489 (2017).
- Jeon, S. J., Ryu, J. H., Bahn, G. H. Altered translational control of fragile X mental retardation protein on myelin proteins in neuropsychiatric disorders. Biomolecules & Therapeutics. 25 (3), 231-238 (2017).
- Barak, B., et al. Neuronal deletion of Gtf2i, associated with Williams syndrome, causes behavioral and myelin alterations rescuable by a remyelinating drug. Nature Neuroscience. 22 (5), 700-708 (2019).
- Phan, B. N., et al. A myelin-related transcriptomic profile is shared by Pitt-Hopkins syndrome models and human autism spectrum disorder. Nature Neuroscience. 23 (3), 375-385 (2020).
- Lucas, A., Poleg, S., Klug, A., McCullagh, E. A. Myelination deficits in the auditory brainstem of a mouse model of fragile X syndrome. Frontiers in Neuroscience. 15, 1536 (2021).
- Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. -. X. Coherent anti-stokes raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal ttissues. Biophysical Journal. 89 (1), 581-591 (2005).
- Kim, S. -. H., et al. Multiplex coherent anti-stokes raman spectroscopy images intact atheromatous lesions and concomitantly identifies distinct chemical profiles of atherosclerotic lipids. Circulation Research. 106 (8), 1332-1341 (2010).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Tu, L., et al. Free-floating Immunostaining of Mouse Brains. Journal of Visualized Experiments. (176), e62876 (2021).
- . Fluorescence SpectraViewer Available from: https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer (2022)
- Held, H. Die centrale gehörleitung. Arch Anat Physiol Anat Abt. 17, 201-248 (1893).
- Sherman, D. L., Brophy, P. J. Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth. Nature Reviews Neuroscience. 6 (9), 683-690 (2005).
- Gruchot, J., et al. The molecular basis for remyelination failure in multiple sclerosis. Cells. 8 (8), 825 (2019).
- Rivera, A. D., et al. Epidermal growth factor pathway in the age-related decline of oligodendrocyte regeneration. Frontiers in Cellular Neuroscience. 16, 838007 (2022).
- Kútna, V., O’Leary, V. B., Hoschl, C., Ovsepian, S. V. Cerebellar demyelination and neurodegeneration associated with mTORC1 hyperactivity may contribute to the developmental onset of autism-like neurobehavioral phenotype in a rat model. Autism Research: Official Journal of the International Society for Autism Research. 15 (5), 791-805 (2022).
- Ozsvár, A., et al. Quantitative analysis of lipid debris accumulation caused by cuprizone induced myelin degradation in different CNS areas. Brain Research Bulletin. 137, 277-284 (2018).
- Prineas, J. W., Graham, J. S. Multiple sclerosis: capping of surface immunoglobulin G on macrophages engaged in myelin breakdown. Annals of Neurology. 10 (2), 149-158 (1981).
- Bégin, S., et al. Automated method for the segmentation and morphometry of nerve fibers in large-scale CARS images of spinal cord tissue. Biomedical Optics Express. 5 (12), 4145-4161 (2014).
