Aplicación de espectroscopía Raman anti-Stokes coherente (CARS) para la mielinización de imágenes en cortes cerebrales
Summary
Visualizar la mielinización es un objetivo importante para muchos investigadores que estudian el sistema nervioso. CARS es una técnica que es compatible con la inmunofluorescencia que puede obtener imágenes nativas de lípidos dentro de tejidos como el cerebro que iluminan estructuras especializadas como la mielina.
Abstract
La espectroscopia Raman anti-Stokes coherente (CARS) es una técnica empleada clásicamente por químicos y físicos para producir una señal coherente de vibraciones de firma de moléculas. Sin embargo, estas firmas vibratorias también son características de las moléculas dentro del tejido anatómico como el cerebro, lo que lo hace cada vez más útil y aplicable para aplicaciones de neurociencia. Por ejemplo, CARS puede medir los lípidos mediante enlaces químicos específicamente excitantes dentro de estas moléculas, lo que permite la cuantificación de diferentes aspectos del tejido, como la mielina involucrada en la neurotransmisión. Además, en comparación con otras técnicas típicamente utilizadas para cuantificar la mielina, CARS también se puede configurar para ser compatible con técnicas inmunofluorescentes, lo que permite el etiquetado conjunto con otros marcadores como canales de sodio u otros componentes de la transmisión sináptica. Los cambios en la mielinización son un mecanismo inherentemente importante en enfermedades desmielinizantes como la esclerosis múltiple u otras afecciones neurológicas como el síndrome X frágil o los trastornos del espectro autista es un área emergente de investigación. En conclusión, CARS se puede utilizar de manera innovadora para responder preguntas apremiantes en neurociencia y proporcionar evidencia de mecanismos subyacentes relacionados con muchas afecciones neurológicas diferentes.
Introduction
Los potenciales de acción son la unidad básica de información en el cerebro, y la propagación del potencial de acción a través de los axones forma un pilar del procesamiento de la información 1,2,3. Las neuronas típicamente reciben entradas aferentes de múltiples otras neuronas e integran estas entradas dentro de una ventana de tiempo estrecha dada 4,5. Por lo tanto, los mecanismos de propagación potencial de los mecanismos de acción en los axones han recibido una cantidad significativa de atención por parte de los investigadores.
Cuando se propaga a través de un axón, un potencial de acción se regenera repetidamente a lo largo del axón para garantizar una propagación confiable6. En la mayoría de las neuronas de los vertebrados con mandíbula (gnatóstomos) los axones están rodeados por una vaina de mielina, que es una sustancia rica en lípidos producida por oligodendrocitos cercanos o células de Schwann, que son tipos de células gliales (revisado en 7,8). Esta vaina de mielina aísla eléctricamente el axón, reduciendo su capacitancia y permitiendo la propagación del potencial de acción de manera eficiente, rápida y con menor consumo de energía. La mielina no cubre el axón de manera uniforme, pero envuelve el axón en segmentos que tienen espacios cortos entre ellos, llamados ganglios de Ranvier (revisado en 9,10). Tanto el espesor de mielinización, que controla el nivel de aislamiento eléctrico de un axón, como el espaciamiento de los nodos de Ranvier, que controlan la frecuencia con la que se regeneran los potenciales de acción a lo largo de un axón, influyen en la velocidad de propagación del potencial de acción (revisado en11).
Existe una gran cantidad de literatura que sugiere que el espesor de la mielinización afecta la velocidad de propagación del potencial de acción en los axones12,13,14. Además, las alteraciones en la mielinización axónica pueden dar lugar a una serie de déficits del SNC 15,16,17,18,19,20,21. Por lo tanto, no es sorprendente que el enfoque de muchos esfuerzos de investigación implique la medición y caracterización de la mielinización axónica. Las mediciones del grosor de la mielina se han realizado más comúnmente con microscopía electrónica, una técnica que requiere una cantidad significativa de preparación de tejido y es difícil de usar en combinación con inmunohistoquímica. Sin embargo, también existe una técnica más rápida y sencilla para medir la mielinización axónica que se basa en la espectroscopia Raman Coherente Anti-Stokes (CARS). Un láser CARS puede ser sintonizado a varias frecuencias y cuando se sintoniza a frecuencias que son adecuadas para excitar lípidos, la mielina puede ser fotografiada sin necesidad de etiquetas adicionales22. La imagen lipídica puede combinarse con inmunohistoquímica estándar, de modo que los lípidos pueden ser fotografiados junto con varios canales fluorescentes23. La mielinización por imágenes con CARS es significativamente más rápida que la microscopía electrónica y tiene una resolución que es, aunque más baja que EM, suficiente para detectar incluso pequeñas diferencias en la mielinización en el mismo tipo de axones.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un creciente cuerpo de literatura enfatiza el papel de la mielina en la función cerebral 13,16,21,28. Además, sabemos que el grosor de la mielinización y el patrón de mielinización pueden cambiar en varias afecciones neurológicas como la esclerosis múltiple (revisada en29), el envejecimiento (revisado en 30), el autismo20,31 y muchas otras….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Compatible con NIH R01 DC 17924, R01 DC 18401 (Klug) y NIH 1R15HD105231-01, T32DC012280 y FRAXA (McCullagh). Las imágenes CARS se realizaron en la parte del Núcleo de Microscopía de Luz Avanzada del Centro de Neurotecnología del Campus Médico Anschutz de la Universidad de Colorado, con el apoyo en parte de NIH P30 NS048154 y NIH P30 DK116073.
Materials
| Anesthetic: | |||
| 1 mL disposable syringe with needle 27 GA x 0.5" | Exel int | 260040 | |
| Fatal + | Vortech | ||
| Surgery: | |||
| Spring Scissors – 8mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| Standard tweezers | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Perfusion: | |||
| 4% Paraformaldehyde | Fisher Chemical | SF994 (CS) | |
| Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14063-11 | |
| Kelly hemostats | Fine Science Tools | 13019-14 | |
| Millipore H2O | |||
| Needle tip, 23 GA x 1" | BD precision glide | 305193 | |
| Phosphate buffered saline (PBS): | |||
| Potassium chloride | Sigma | P9333 | |
| Potassium phosphate monobase | Sigma | P5655 | |
| pump with variable flow or equivalent | |||
| Sodium chloride | Fisher Chemical | s271-1 | |
| Sodiumphosphate dibasic | Sigma | S7907 | |
| Dissection: | |||
| 50 mL vial with 4% PFA | |||
| Bochem Chemical Spoon 180mm | Bochem | 230331000 | |
| Fine Scissors – Sharp | Fine Science Tools | 14063-11 | |
| Noyes Spring Scissors | Fine Science Tools | 15011-12 | |
| Pair of fine (Graefe) tweezers | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Shallow glass or plastic tray, approximately 10" x 10" | |||
| Standard tweezers | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Surgical Scissors – Blunt | Fine Science Tools | 14000-20 | |
| Slicing: | |||
| Agar, plant | RPI | 9002-18-0 | |
| Vibratome | Leica | VT1000s | |
| well plate | Alkali Sci. | TPN1048-NT | |
| Staining: | |||
| AB Media: | 1n 1,000 mL of Millipore H2O | ||
| Phosphate buffered (PB): | |||
| Potassium Phosphate Monobase | Sigma | P5655 | |
| Sodium Phosohate Dibasic | Sigma | S7907 | |
| BSA (Bovine serum albumin) | Sigma life science | A2153-100g | |
| Sodium Chloride | Fisher Chemical | s271-1 | |
| Triton X-100 | Sigma – Aldrich | x100-500ml | |
| Nissl 435/455 | Invitrogen | N21479 | |
| CARS: | |||
| APE picoemerald laser | Angewandte Physik & Elektronik GmbH | ||
| bandpass filter (420-520 nm) | Chroma Technology | HQ470/100m-2P | |
| bandpass filter (500-530 nm) | Chroma Technology | HQ515/30m-2P | |
| bandpass filters (640-680 nm) | Chroma Technology | HQ660/40m-2P | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Cut Transfer pipet | Fisher | 13-711-7M | |
| dichroic longpass 565 nm | Chroma Technology | 565dcxr | |
| dichroic longpass 585 nm | Chroma Technology | 585dcxr | |
| dichroic shortpass 750 nm | Chroma Technology | T750spxrxt | |
| glass bottom culture dish | MatTek | P35G-0-10-C | |
| glass weight (10 mm x 10 mm boro rod) | Allen Scientific Glass Inc | ||
| multiphoton shortpass emission filter 680 nm | Chroma Technology | ET680sp-2p8 | |
| PBS |
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