使用福尔马林固定和石蜡包埋组织样品的质谱成像扩展肿瘤微环境的理解
Summary
在癌症免疫治疗时代，人们对阐明肿瘤微环境动力学的兴趣惊人地增加。该协议详细介绍了质谱成像技术及其染色和成像步骤，允许高度多路复用的空间分析。
Abstract
基于免疫的疗法的进步彻底改变了癌症治疗和研究。这引发了对肿瘤免疫景观表征的需求不断增长。虽然标准免疫组化适用于研究组织结构，但它仅限于分析少量标记物。相反，流式细胞术等技术可以同时评估多个标志物，尽管有关组织形态的信息丢失。近年来，整合表型和空间分析的多重策略已成为表征肿瘤免疫景观的综合方法。 在这里，我们讨论了一种结合金属标记抗体和二次离子质谱的创新技术，重点介绍了测定开发和优化，组织制备以及图像采集和处理中的技术步骤。在染色之前，必须开发和优化金属标记的抗体组合。这种高复级图像系统在单个组织切片中支持多达40种金属标记的抗体。值得注意的是，信号干扰的风险随着面板中包含的标记数量而增加。在设计面板后，应特别注意对抗体的金属同位素分配，以尽量减少这种干扰。使用一小部分抗体进行初步的面板测试，随后在对照组织中对整个面板进行测试。获得福尔马林固定的石蜡包埋组织切片并将其安装在镀金载玻片上并进一步染色。染色需要2天，与标准免疫组化染色非常相似。一旦样品被染色，它们就被放置在图像采集仪器中。选择视野，获取、上传和存储图像。最后阶段是图像准备，以便使用系统的图像处理软件进行滤波和消除干扰。该平台的缺点是缺乏分析软件。但是，生成的图像由不同的计算病理学软件支持。
Introduction
克隆性肿瘤群体周围众多细胞类型的重要性是癌变分类的关键因素。在建立基于免疫的疗法作为癌症治疗武器库的一部分之后，对阐明这种肿瘤微环境（TME）组成和相互作用的兴趣不断上升。因此，治疗策略已从以肿瘤为中心的方法转变为以TME为中心的方法1。
近年来，阐明免疫细胞在肿瘤监测和癌症发展中的作用的努力急剧增加2，3.在医学研究中，大量的方法，包括基于细胞术的方法以及单重和多重成像技术，作为破译TME多种元素独特相互作用的尝试的一部分， 出现了。
流式细胞术（20世纪60年代发明）、荧光活化细胞分选和质量细胞术等开创性方法主要集中在鉴定和定量TME组分4上。尽管基于细胞术的定量技术允许免疫景观表型分析，但确定细胞空间分布是不可能的。相反，诸如标准单重免疫组织化学之类的方法保留了组织结构并使研究人员能够分析细胞分布，尽管单个组织切片中靶标数量的减少是这些方法的局限性5，6。在过去几年中，用于单细胞分辨率的多重成像技术（如多重免疫荧光，条形码荧光成像和成像质谱）已成为使用相同的组织切片7获取同时标记染色信息的综合策略。
在这里，我们介绍了一种将金属标记抗体和二次离子质谱耦合的技术，并使用福尔马林固定，石蜡包埋（FFPE）和新鲜冷冻（FF）组织样品8，9实现单细胞分辨率定量，标记物共表达（表型）和空间分析。FFPE样品是用于组织存档样品的最广泛使用的材料，并且比新鲜冷冻样品10更容易获得多重成像技术。此外，该技术还提供了在几个月后重新获取图像的可能性。在这里，我们讨论了使用FFPE组织样品的染色和图像处理方案。
Protocol
Representative Results
Discussion
全面阐明TME多个组成部分之间复杂而复杂的相互作用仍然是癌症研究的关键目标。作为这项工作的一部分，制造商已经推出了许多多重检测方法，特别是在过去的5年中。多重空间分析是一种多功能且功能强大的工具，有助于同时对多个靶标进行分类，同时保持肿瘤样品中的结构形态。空间分析技术可以使用荧光成像或质谱法进行，例如本文11、12、<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢来自编辑服务，MD安德森研究医学图书馆编辑服务的Don Norwood编辑本文以及MD安德森翻译分子病理学系的多重免疫荧光和图像分析实验室。该出版物的部分结果来自通过美国国家癌症研究所（NCI）合作协议（U24CA224285）向德克萨斯大学MD安德森癌症中心癌症免疫监测和分析中心（CIMAC）提供的癌症免疫监测和分析中心 – 癌症免疫数据共享网络（CIMAC-CIDC）的科学和财政支持所促进的研究。
Materials
| 100% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R8382 | |
| 95% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R3404 | |
| 80% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R3279 | |
| 70% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R315 | |
| 20X TBS-T | Ionpath | 567005 | |
| 10X Low-Barium PBS pH 7.4 | Ionpath | 567004 | |
| 10X Tris pH 8.5 | Ionpath | 567003 | |
| 4°C Refrigerator | ThermoScientific | REVCO | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P10 | Olympus | 24-401 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P20 | Olympus | 24-404 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P200 | Olympus | 24-412 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P1000 | Olympus | 24-430 | |
| Centrifugal Filter Ultrafree-MC | Fisher Scientific | UFC30VV00 | |
| Deionized H2O | Ionpath | 567002 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| EasyDip Slide Staining Jar, Green | Electron Microscopy Sciences | 71385-G | |
| EasyDip Slide Staining Jar, Yellow | Electron Microscopy Sciences | 71385-Y | |
| EasyDip Slide Staining Kit (Jar+Rack), White | Electron Microscopy Sciences | 71388-01 | |
| EasyDip Stainless Steel Holder | Electron Microscopy Sciences | 71388-50 | |
| Glutaraldehyde 70% EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 16360 | |
| Heat Induced Epitope Retrieval (HIER) buffer: 10X Tris with EDTA, pH 9 | Dako | S2367 | |
| Heat resistant slide chamber | Electron Microscopy Sciences | 62705-01 | |
| Hydrophobic barrier pen | Fisher | 50-550-221 | |
| MIBI/O software | Ionpath | NA | |
| MIBIcontrol software | Ionpath | NA | |
| MIBIslide | Ionpath | 567001 | |
| MIBIscope | Ionpath | NA | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Moisture Chamber (Humid Chamber) | Simport | M922-1 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets | Fisher Scientific | BP2944100 | |
| PT Module | Thermo Scientific | A80400012 | |
| Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units | Fisher Scientific | 097403A | |
| Shaker | BioRocker | S2025 | |
| Spin column (Ultrafree-MC Spin Filter, 0.5mL 0.1μm ) | MillQ | UFC30VV00 | |
| Slide oven | Fisher Scientific | 6901 | |
| Vaccum Cabinet Desiccator | VWR | 30621-076 | |
| Task-whipe | Kimberly Clark | 34155 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056-4L |
References
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