הרחבת ההבנה של המיקרו-סביבה של הגידול באמצעות הדמיית ספקטרומטריית מסה של דגימות רקמה קבועות פורמלין ומשובצות פרפין
Summary
בעידן האימונותרפיה של הסרטן, העניין בהבהרת הדינמיקה של מיקרו-סביבה של הגידול גדל באופן בולט. פרוטוקול זה מפרט טכניקת הדמיה של ספקטרומטריית מסה ביחס לשלבי הצביעה וההדמיה שלה, המאפשרים אנליזה מרחבית מרובבת מאוד.
Abstract
ההתקדמות בטיפולים מבוססי חיסון חוללה מהפכה בטיפול בסרטן ובמחקר. זה עורר ביקוש הולך וגובר לאפיון הנוף החיסוני של הגידול. למרות שאימונוהיסטוכימיה סטנדרטית מתאימה לחקר ארכיטקטורת רקמות, היא מוגבלת לניתוח של מספר קטן של סמנים. לעומת זאת, טכניקות כגון ציטומטריה של זרימה יכולות להעריך סמנים מרובים בו זמנית, אם כי מידע על מורפולוגיה של רקמות הולך לאיבוד. בשנים האחרונות, אסטרטגיות מרובות המשלבות ניתוח פנוטיפי ומרחבי התפתחו כגישות מקיפות לאפיון הנוף החיסוני של הגידול. במאמר זה נדון בטכנולוגיה חדשנית המשלבת נוגדנים בעלי תווית מתכת וספקטרומטריית מסת יונים משנית המתמקדת בשלבים הטכניים בפיתוח ואופטימיזציה של בדיקות, הכנת רקמות ורכישה ועיבוד תמונה. לפני הצביעה, יש לפתח פאנל נוגדנים עם תווית מתכת ולייעל. מערכת תמונה גבוהה זו תומכת בעד 40 נוגדנים המתויגים במתכת במקטע רקמה אחד. שימו לב, הסיכון להפרעות אות עולה עם מספר הסמנים הכלולים בלוח. לאחר תכנון הפאנל, יש לתת תשומת לב מיוחדת להקצאת איזוטופ המתכת לנוגדן כדי למזער הפרעה זו. בדיקת פאנל ראשונית מתבצעת באמצעות תת-קבוצה קטנה של נוגדנים ולאחר מכן בדיקה של הלוח כולו ברקמות הבקרה. מקטעי רקמה קבועים בפורמלין, משובצים בפרפין, מתקבלים ומותקנים על שקופיות מצופות זהב ומוכתמות עוד יותר. ההכתמה אורכת יומיים ודומה מאוד לצביעה אימונוהיסטוכימית סטנדרטית. לאחר שהדגימות מוכתמות, הן ממוקמות במכשיר רכישת התמונה. שדות תצוגה נבחרים, ותמונות נרכשות, מועלות ומאוחסנות. השלב הסופי הוא הכנת התמונה לסינון והסרת הפרעות באמצעות תוכנת עיבוד התמונה של המערכת. חסרון של פלטפורמה זו הוא היעדר תוכנה אנליטית. עם זאת, התמונות שנוצרו נתמכות על ידי תוכנות פתולוגיה חישוביות שונות.
Introduction
חשיבותם של סוגי התאים הרבים המקיפים את אוכלוסיות הגידול הקלונלי היא מרכיב מכריע בסיווג של קרצינוגנזה. העניין בהבהרת הרכב המיקרו-סביבה של הגידול (TME) והאינטראקציות איתו עלה ברציפות בעקבות הקמת טיפול מבוסס חיסון כחלק מארסנל הטיפול בסרטן. לכן, אסטרטגיות הטיפול עברו מגישה ממוקדת גידול לגישה ממוקדת TME1.
המאמצים להבהיר את התפקידים של תאי מערכת החיסון במעקב אחר גידולים ובהתפתחות סרטן עלו באופן בולט בשנים האחרונות 2,3. במחקר הרפואי, שפע של שיטות, כולל שיטות מבוססות ציטומטריה וטכנולוגיות הדמיה של סינגלפלקס ומולטיפלקס, נוצרו כחלק מניסיון זה לפענח את האינטראקציות הייחודיות של אלמנטים מרובים של TMEs.
שיטות חלוציות כגון ציטומטריה של זרימה (שהומצאה בשנות ה-60 של המאה ה-20), מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנציה וציטומטריה המונית מתמקדות בעיקר בזיהוי וכימות רכיבי TME4. אף על פי שטכניקות כמותיות מבוססות ציטומטריה מאפשרות פנוטיפ של הנוף החיסוני, קביעת ההתפלגות המרחבית של התאים אינה אפשרית. לעומת זאת, שיטות כמו אימונוהיסטוכימיה סטנדרטית של סינגלפלקס משמרות את ארכיטקטורת הרקמה ומאפשרות לחוקרים לנתח את התפלגות התאים, אם כי מספר מופחת של מטרות בחלק רקמה אחת הוא מגבלה של שיטות אלה 5,6. במהלך השנים האחרונות, טכנולוגיות הדמיה מרובות עבור רזולוציה של תא יחיד כגון אימונופלואורסצנציה מרובה, הדמיית ברקוד פלואורסצנטי וספקטרומטריית מסה הדמיה התפתחו כאסטרטגיות מקיפות להשגת מידע על צביעת סמנים בו זמנית באמצעות אותה רקמה סעיף7.
כאן אנו מציגים טכנולוגיה המשלבת נוגדנים מתויגים במתכת וספקטרומטריית מסת יונים משנית ומאפשרת כימות ברזולוציה של תא בודד, ביטוי משותף של סמנים (פנוטיפינג) ואנליזה מרחבית באמצעות פורמלין קבוע, משובץ פרפין (FFPE) ודגימות רקמה קפואות טריות (FF) 8,9. דגימות FFPE הן החומרים הנפוצים ביותר עבור דגימות ארכיון רקמות ומייצגות משאב זמין יותר עבור טכנולוגיות הדמיה מרובות מאשר דגימות קפואות טריות10. בנוסף, טכנולוגיה זו מציעה את האפשרות לרכוש מחדש תמונות חודשים לאחר מכן. כאן נדון בפרוטוקולי הצביעה ועיבוד התמונה שלנו באמצעות דגימות רקמות FFPE.
Protocol
Representative Results
Discussion
ההבהרה המקיפה של יחסי הגומלין המורכבים והמורכבים בין המרכיבים המרובים של TME נותרה מטרה מרכזית בחקר הסרטן. היצרנים הציגו מבחנים מרובים רבים כחלק ממאמץ זה, במיוחד במהלך 5 השנים האחרונות. ניתוח מרחבי מרובב הוא כלי רב-תכליתי ורב עוצמה המאפשר סיווג סימולטני של מספר מטרות תוך שמירה על מורפולוגי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לדון נורווד משירותי עריכה, מהספרייה הרפואית למחקר ב- MD Anderson על עריכת מאמר זה ומהמעבדה לאימונופלואורסצנציה וניתוח תמונות במחלקה לפתולוגיה מולקולרית תרגומית ב- MD Anderson. פרסום זה נבע בחלקו ממחקר שהתאפשר על ידי התמיכה המדעית והכספית במרכזי הניטור והניתוח של מערכת החיסון לסרטן – רשת הנתונים האימונולוגיים של הסרטן (CIMAC-CIDC) שסופקו באמצעות הסכם שיתוף הפעולה של המכון הלאומי לסרטן (NCI) (U24CA224285) למרכז הסרטן של אוניברסיטת טקסס MD Anderson מרכז לניטור וניתוח חיסונים לסרטן (CIMAC).
Materials
| 100% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R8382 | |
| 95% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R3404 | |
| 80% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R3279 | |
| 70% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R315 | |
| 20X TBS-T | Ionpath | 567005 | |
| 10X Low-Barium PBS pH 7.4 | Ionpath | 567004 | |
| 10X Tris pH 8.5 | Ionpath | 567003 | |
| 4°C Refrigerator | ThermoScientific | REVCO | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P10 | Olympus | 24-401 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P20 | Olympus | 24-404 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P200 | Olympus | 24-412 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P1000 | Olympus | 24-430 | |
| Centrifugal Filter Ultrafree-MC | Fisher Scientific | UFC30VV00 | |
| Deionized H2O | Ionpath | 567002 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| EasyDip Slide Staining Jar, Green | Electron Microscopy Sciences | 71385-G | |
| EasyDip Slide Staining Jar, Yellow | Electron Microscopy Sciences | 71385-Y | |
| EasyDip Slide Staining Kit (Jar+Rack), White | Electron Microscopy Sciences | 71388-01 | |
| EasyDip Stainless Steel Holder | Electron Microscopy Sciences | 71388-50 | |
| Glutaraldehyde 70% EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 16360 | |
| Heat Induced Epitope Retrieval (HIER) buffer: 10X Tris with EDTA, pH 9 | Dako | S2367 | |
| Heat resistant slide chamber | Electron Microscopy Sciences | 62705-01 | |
| Hydrophobic barrier pen | Fisher | 50-550-221 | |
| MIBI/O software | Ionpath | NA | |
| MIBIcontrol software | Ionpath | NA | |
| MIBIslide | Ionpath | 567001 | |
| MIBIscope | Ionpath | NA | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Moisture Chamber (Humid Chamber) | Simport | M922-1 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets | Fisher Scientific | BP2944100 | |
| PT Module | Thermo Scientific | A80400012 | |
| Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units | Fisher Scientific | 097403A | |
| Shaker | BioRocker | S2025 | |
| Spin column (Ultrafree-MC Spin Filter, 0.5mL 0.1μm ) | MillQ | UFC30VV00 | |
| Slide oven | Fisher Scientific | 6901 | |
| Vaccum Cabinet Desiccator | VWR | 30621-076 | |
| Task-whipe | Kimberly Clark | 34155 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056-4L |
References
- Laplane, L., Duluc, D., Bikfalvi, A., Larmonier, N., Pradeu, T. Beyond the tumour microenvironment. International Journal of Cancer. 145 (10), 2611-2618 (2019).
- Galli, F., et al. Relevance of immune cell and tumor microenvironment imaging in the new era of immunotherapy. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 39 (1), 89 (2020).
- Liu, C. C., Steen, C. B., Newman, A. M. Computational approaches for characterizing the tumor immune microenvironment. Immunology. 158 (2), 70-84 (2019).
- Eisenstein, M. Cell sorting: Divide and conquer. Nature. 441 (7097), 1179-1185 (2006).
- Scognamiglio, G., et al. Multiplex immunohistochemistry assay to evaluate the melanoma tumor microenvironment. Methods in Enzymology. 635, 21-31 (2020).
- Guo, N., et al. A 34-marker panel for imaging mass cytometric analysis of human snap-frozen tissue. Frontiers in Immunology. 11, 1466 (2020).
- Fu, T., et al. Spatial architecture of the immune microenvironment orchestrates tumor immunity and therapeutic response. Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 98 (2021).
- Rost, S., et al. Multiplexed ion beam imaging analysis for quantitation of protein expresssion in cancer tissue sections. Laboratory Investigation. 97 (8), 992-1003 (2017).
- Keren, L., et al. A structured tumor-immune microenvironment in triple negative breast cancer revealed by multiplexed ion beam imaging. Cell. 174 (6), 1373-1387 (2018).
- Mathieson, W., Thomas, G. A. Why formalin-fixed, paraffin-embedded biospecimens must be used in genomic medicine: An evidence-based review and conclusion. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 68 (8), 543-552 (2020).
- Baghban, R., et al. Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 59 (2020).
- Cai, S., Allam, M., Coskun, A. F. Multiplex spatial bioimaging for combination therapy design. Trends in Cancer. 6 (10), 813-818 (2020).
- Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics. NPJ Precision Oncology. 4, 11 (2020).
- Rad, H. S., et al. The Pandora’s box of novel technologies that may revolutionize lung cancer. Lung Cancer. 159, 34-41 (2021).
- Tan, W. C. C., et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Commununications. 40 (4), 135-153 (2020).
- Ptacek, J., et al. Multiplexed ion beam imaging (MIBI) for characterization of the tumor microenvironment across tumor types. Laboratory Investigation. 100 (8), 1111-1123 (2020).
