Ampliación de la comprensión del microambiente tumoral mediante imágenes de espectrometría de masas de muestras de tejido fijadas en formalina e incrustadas en parafina
Summary
En la era de la inmunoterapia contra el cáncer, el interés en dilucidar la dinámica del microambiente tumoral ha aumentado sorprendentemente. Este protocolo detalla una técnica de imagen de espectrometría de masas con respecto a sus pasos de tinción e imagen, que permiten un análisis espacial altamente multiplexado.
Abstract
Los avances en las terapias basadas en el sistema inmunitario han revolucionado el tratamiento y la investigación del cáncer. Esto ha desencadenado una creciente demanda para la caracterización del paisaje inmune tumoral. Aunque la inmunohistoquímica estándar es adecuada para estudiar la arquitectura de los tejidos, se limita al análisis de un pequeño número de marcadores. Por el contrario, técnicas como la citometría de flujo pueden evaluar múltiples marcadores simultáneamente, aunque se pierde información sobre la morfología del tejido. En los últimos años, las estrategias multiplexadas que integran el análisis fenotípico y espacial han surgido como enfoques integrales para la caracterización del paisaje inmune tumoral. Aquí, discutimos una tecnología innovadora que combina anticuerpos marcados con metal y espectrometría de masas de iones secundarios que se centra en los pasos técnicos en el desarrollo y optimización de ensayos, la preparación de tejidos y la adquisición y procesamiento de imágenes. Antes de la tinción, se debe desarrollar y optimizar un panel de anticuerpos marcado con metal. Este sistema de imagen hi-plex admite hasta 40 anticuerpos marcados con metal en una sola sección de tejido. Cabe destacar que el riesgo de interferencia de señal aumenta con el número de marcadores incluidos en el panel. Después del diseño del panel, se debe prestar especial atención a la asignación de isótopos metálicos al anticuerpo para minimizar esta interferencia. Las pruebas preliminares de panel se realizan utilizando un pequeño subconjunto de anticuerpos y pruebas posteriores de todo el panel en tejidos de control. Las secciones de tejido fijadas en formalina e incrustadas en parafina se obtienen y montan en portaobjetos recubiertos de oro y se tiñen aún más. La tinción dura 2 días y se parece mucho a la tinción inmunohistoquímica estándar. Una vez que las muestras se tiñen, se colocan en el instrumento de adquisición de imágenes. Se seleccionan los campos de vista y se adquieren, cargan y almacenan las imágenes. La etapa final es la preparación de la imagen para el filtrado y la eliminación de interferencias utilizando el software de procesamiento de imágenes del sistema. Una desventaja de esta plataforma es la falta de software analítico. Sin embargo, las imágenes generadas son compatibles con diferentes software de patología computacional.
Introduction
La importancia de los numerosos tipos de células que rodean a las poblaciones de tumores clonales es un elemento crucial en la categorización de la carcinogénesis. El interés en dilucidar esta composición e interacciones del microambiente tumoral (TME) ha aumentado continuamente después del establecimiento de la terapia basada en el sistema inmunitario como parte del arsenal de tratamiento del cáncer. Por lo tanto, las estrategias de tratamiento han pasado de un enfoque centrado en el tumor a uno centrado en TME1.
Los esfuerzos para dilucidar el papel de las células inmunes en la vigilancia tumoral y el desarrollo del cáncer han aumentado notablemente en los últimos años 2,3. En la investigación médica, surgió una gran cantidad de métodos, incluidos los métodos basados en citometría y las tecnologías de imágenes singleplex y multiplex, como parte de este intento de descifrar las interacciones únicas de múltiples elementos de TME.
Los métodos pioneros como la citometría de flujo (inventada en la década de 1960), la clasificación celular activada por fluorescencia y la citometría de masas se centran principalmente en identificar y cuantificar los componentes de TME4. Aunque las técnicas cuantitativas basadas en la citometría permiten el fenotipado del paisaje inmune, determinar la distribución espacial celular es imposible. Por el contrario, métodos como la inmunohistoquímica singleplex estándar preservan la arquitectura tisular y permiten a los investigadores analizar la distribución celular, aunque un número reducido de dianas en una sola sección de tejido es una limitación de estos métodos 5,6. En los últimos años, las tecnologías de imágenes multiplexadas para la resolución de una sola célula, como la inmunofluorescencia múltiple, las imágenes de fluorescencia de código de barras y la espectrometría de masas de imágenes, han surgido como estrategias integrales para adquirir información sobre la tinción simultánea de marcadores utilizando la misma sección7 de tejido.
Aquí presentamos una tecnología que combina anticuerpos marcados con metales y espectrometría de masas de iones secundarios y permite la cuantificación de resolución de células individuales, la coexpresión de marcadores (fenotipado) y el análisis espacial utilizando muestras de tejido fijado en formalina, embebido en parafina (FFPE) y congelado fresco (FF) 8,9. Las muestras FFPE son los materiales más utilizados para el archivo de muestras de tejidos y representan un recurso más fácilmente disponible para las tecnologías de imágenes multiplexadas que las muestras congeladas frescas10. Además, esta tecnología ofrece la posibilidad de volver a adquirir imágenes meses después. Aquí, discutimos nuestros protocolos de tinción y procesamiento de imágenes utilizando muestras de tejido FFPE.
Protocol
Representative Results
Discussion
La elucidación exhaustiva de las complejas e intrincadas interacciones entre los múltiples componentes de un TME sigue siendo un objetivo fundamental de la investigación del cáncer. Los fabricantes han introducido numerosos ensayos multiplexados como parte de este esfuerzo, especialmente en los últimos 5 años. El análisis espacial multiplexado es una herramienta versátil y poderosa que facilita la categorización simultánea de varios objetivos al tiempo que preserva la morfología estructural en muestras tumoral…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Don Norwood de Editing Services, Research Medical Library del MD Anderson por editar este artículo y al Multiplex Immunofluorescence and Image Analysis Laboratory del Department of Translational Molecular Pathology del MD Anderson. Esta publicación resultó en parte de la investigación facilitada por el apoyo científico y financiero para los Centros de Análisis y Monitoreo Inmunológico del Cáncer-Red de Datos Inmunológicos del Cáncer (CIMAC-CIDC) proporcionado a través del Acuerdo de Cooperación del Instituto Nacional del Cáncer (NCI) (U24CA224285) al Centro de Análisis y Monitoreo Inmunológico del Cáncer (CIMAC) del MD Anderson Cancer Center de la Universidad de Texas.
Materials
| 100% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R8382 | |
| 95% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R3404 | |
| 80% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R3279 | |
| 70% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R315 | |
| 20X TBS-T | Ionpath | 567005 | |
| 10X Low-Barium PBS pH 7.4 | Ionpath | 567004 | |
| 10X Tris pH 8.5 | Ionpath | 567003 | |
| 4°C Refrigerator | ThermoScientific | REVCO | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P10 | Olympus | 24-401 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P20 | Olympus | 24-404 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P200 | Olympus | 24-412 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P1000 | Olympus | 24-430 | |
| Centrifugal Filter Ultrafree-MC | Fisher Scientific | UFC30VV00 | |
| Deionized H2O | Ionpath | 567002 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| EasyDip Slide Staining Jar, Green | Electron Microscopy Sciences | 71385-G | |
| EasyDip Slide Staining Jar, Yellow | Electron Microscopy Sciences | 71385-Y | |
| EasyDip Slide Staining Kit (Jar+Rack), White | Electron Microscopy Sciences | 71388-01 | |
| EasyDip Stainless Steel Holder | Electron Microscopy Sciences | 71388-50 | |
| Glutaraldehyde 70% EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 16360 | |
| Heat Induced Epitope Retrieval (HIER) buffer: 10X Tris with EDTA, pH 9 | Dako | S2367 | |
| Heat resistant slide chamber | Electron Microscopy Sciences | 62705-01 | |
| Hydrophobic barrier pen | Fisher | 50-550-221 | |
| MIBI/O software | Ionpath | NA | |
| MIBIcontrol software | Ionpath | NA | |
| MIBIslide | Ionpath | 567001 | |
| MIBIscope | Ionpath | NA | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Moisture Chamber (Humid Chamber) | Simport | M922-1 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets | Fisher Scientific | BP2944100 | |
| PT Module | Thermo Scientific | A80400012 | |
| Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units | Fisher Scientific | 097403A | |
| Shaker | BioRocker | S2025 | |
| Spin column (Ultrafree-MC Spin Filter, 0.5mL 0.1μm ) | MillQ | UFC30VV00 | |
| Slide oven | Fisher Scientific | 6901 | |
| Vaccum Cabinet Desiccator | VWR | 30621-076 | |
| Task-whipe | Kimberly Clark | 34155 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056-4L |
References
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