Utöka förståelsen av tumörmikromiljön med hjälp av masspektrometriavbildning av formalinfixerade och paraffininbäddade vävnadsprover
Summary
I en tid av cancerimmunterapi har intresset för att belysa tumörmikromiljödynamiken ökat slående. Detta protokoll beskriver en masspektrometriavbildningsteknik med avseende på dess färgnings- och avbildningssteg, vilket möjliggör mycket multiplexerad rumslig analys.
Abstract
Framsteg inom immunbaserade terapier har revolutionerat cancerbehandling och forskning. Detta har utlöst en växande efterfrågan på karakterisering av tumörimmunlandskapet. Även om standardimmunhistokemi är lämplig för att studera vävnadsarkitektur, är den begränsad till analys av ett litet antal markörer. Omvänt kan tekniker som flödescytometri utvärdera flera markörer samtidigt, även om information om vävnadsmorfologi går förlorad. Under de senaste åren har multiplexerade strategier som integrerar fenotypisk och rumslig analys framkommit som omfattande tillvägagångssätt för karakterisering av tumörimmunlandskapet. Häri diskuterar vi en innovativ teknik som kombinerar metallmärkta antikroppar och sekundär jonmasspektrometri med fokus på de tekniska stegen i analysutveckling och optimering, vävnadsberedning och bildförvärv och bearbetning. Före färgning måste en metallmärkt antikroppspanel utvecklas och optimeras. Detta hi-plex-bildsystem stöder upp till 40 metallmärkta antikroppar i en enda vävnadssektion. Observera att risken för signalstörningar ökar med antalet markörer som ingår i panelen. Efter paneldesign bör särskild uppmärksamhet ägnas åt metallisotoptilldelningen till antikroppen för att minimera denna interferens. Preliminär paneltestning utförs med hjälp av en liten delmängd av antikroppar och efterföljande testning av hela panelen i kontrollvävnader. Formalinfixerade, paraffinbäddade vävnadssektioner erhålls och monteras på guldbelagda glidbanor och färgas ytterligare. Färgningen tar 2 dagar och liknar standard immunohistokemisk färgning. När proverna är färgade placeras de i bildförvärvsinstrumentet. Vyfält väljs och bilder hämtas, laddas upp och lagras. Det sista steget är bildförberedelser för filtrering och borttagning av störningar med hjälp av systemets bildbehandlingsprogram. En nackdel med denna plattform är bristen på analytisk programvara. De genererade bilderna stöds dock av olika beräkningspatologiprogram.
Introduction
Betydelsen av de många celltyper som omger klonala tumörpopulationer är ett avgörande element i kategoriseringen av cancerframkallande. Intresset för att belysa denna tumörmikromiljö (TME) sammansättning och interaktioner har ökat kontinuerligt efter etableringen av immunbaserad terapi som en del av cancerbehandlingsarsenalen. Därför har behandlingsstrategier skiftat från ett tumörcentrerat tillvägagångssätt till ett TME-centrerat1.
Arbetet med att belysa immuncellernas roll i tumörövervakning och cancerutveckling har ökat påfallande de senaste åren 2,3. Inom medicinsk forskning uppstod en uppsjö av metoder, inklusive cytometribaserade metoder och singleplex- och multiplexavbildningsteknik, som en del av detta försök att dechiffrera de unika interaktionerna mellan flera element i TME.
Banbrytande metoder som flödescytometri (uppfunnen på 1960-talet), fluorescensaktiverad cellsortering och masscytometri fokuserar främst på att identifiera och kvantifiera TME-komponenter4. Även om cytometribaserade kvantitativa tekniker möjliggör fenotypning av immunlandskap, är det omöjligt att bestämma den cellulära rumsliga fördelningen. Omvänt bevarar metoder som standard singleplex immunohistokemi vävnadsarkitekturen och gör det möjligt för forskare att analysera cellulär fördelning, även om ett minskat antal mål i en enda vävnadssektion är en begränsning av dessa metoder 5,6. Under de senaste åren har multiplexerad bildteknik för encellsupplösning såsom multiplex immunofluorescens, streckkodning av fluorescensavbildning och avbildning av masspektrometri framkommit som omfattande strategier för att få information om samtidig markörfärgning med samma vävnadssektion7.
Här presenterar vi en teknik som kopplar ihop metallmärkta antikroppar och sekundär jonmasspektrometri och möjliggör kvantifiering av encellsupplösning, markörsamuttryck (fenotypning) och rumslig analys med hjälp av formalinfixerade, paraffinbäddade (FFPE) och färskfrysta (FF) vävnadsprover 8,9. FFPE-prover är de mest använda materialen för vävnadsarkivering av prover och utgör en mer lättillgänglig resurs för multiplexerad bildteknik än färska frysta prover10. Dessutom erbjuder denna teknik möjligheten att återta bilder månader efter. Häri diskuterar vi våra färgnings- och bildbehandlingsprotokoll med hjälp av FFPE-vävnadsprover.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den omfattande belysningen av de komplexa, invecklade interaktionerna mellan de många komponenterna i en TME är fortfarande ett centralt mål för cancerforskning. Tillverkare har introducerat många multiplexerade analyser som en del av denna ansträngning, särskilt under de senaste 5 åren. Multiplexerad rumslig analys är ett mångsidigt och kraftfullt verktyg som underlättar samtidig kategorisering av flera mål samtidigt som strukturell morfologi i tumörprover bevaras. Rumsliga analystekniker kan utföras med h…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna erkänner Don Norwood från Editing Services, Research Medical Library vid MD Anderson för redigering av denna artikel och Multiplex Immunofluorescence and Image Analysis Laboratory vid Institutionen för translationell molekylär patologi vid MD Anderson. Denna publikation resulterade delvis från forskning som underlättades av det vetenskapliga och ekonomiska stödet till Cancer Immune Monitoring and Analysis Centers-Cancer Immunologic Data Commons Network (CIMAC-CIDC) som tillhandahålls genom National Cancer Institute (NCI) Cooperative Agreement (U24CA224285) till University of Texas MD Anderson Cancer Center Cancer Immune Monitoring and Analysis Center (CIMAC).
Materials
| 100% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R8382 | |
| 95% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R3404 | |
| 80% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R3279 | |
| 70% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R315 | |
| 20X TBS-T | Ionpath | 567005 | |
| 10X Low-Barium PBS pH 7.4 | Ionpath | 567004 | |
| 10X Tris pH 8.5 | Ionpath | 567003 | |
| 4°C Refrigerator | ThermoScientific | REVCO | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P10 | Olympus | 24-401 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P20 | Olympus | 24-404 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P200 | Olympus | 24-412 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P1000 | Olympus | 24-430 | |
| Centrifugal Filter Ultrafree-MC | Fisher Scientific | UFC30VV00 | |
| Deionized H2O | Ionpath | 567002 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| EasyDip Slide Staining Jar, Green | Electron Microscopy Sciences | 71385-G | |
| EasyDip Slide Staining Jar, Yellow | Electron Microscopy Sciences | 71385-Y | |
| EasyDip Slide Staining Kit (Jar+Rack), White | Electron Microscopy Sciences | 71388-01 | |
| EasyDip Stainless Steel Holder | Electron Microscopy Sciences | 71388-50 | |
| Glutaraldehyde 70% EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 16360 | |
| Heat Induced Epitope Retrieval (HIER) buffer: 10X Tris with EDTA, pH 9 | Dako | S2367 | |
| Heat resistant slide chamber | Electron Microscopy Sciences | 62705-01 | |
| Hydrophobic barrier pen | Fisher | 50-550-221 | |
| MIBI/O software | Ionpath | NA | |
| MIBIcontrol software | Ionpath | NA | |
| MIBIslide | Ionpath | 567001 | |
| MIBIscope | Ionpath | NA | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Moisture Chamber (Humid Chamber) | Simport | M922-1 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets | Fisher Scientific | BP2944100 | |
| PT Module | Thermo Scientific | A80400012 | |
| Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units | Fisher Scientific | 097403A | |
| Shaker | BioRocker | S2025 | |
| Spin column (Ultrafree-MC Spin Filter, 0.5mL 0.1μm ) | MillQ | UFC30VV00 | |
| Slide oven | Fisher Scientific | 6901 | |
| Vaccum Cabinet Desiccator | VWR | 30621-076 | |
| Task-whipe | Kimberly Clark | 34155 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056-4L |
References
- Laplane, L., Duluc, D., Bikfalvi, A., Larmonier, N., Pradeu, T. Beyond the tumour microenvironment. International Journal of Cancer. 145 (10), 2611-2618 (2019).
- Galli, F., et al. Relevance of immune cell and tumor microenvironment imaging in the new era of immunotherapy. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 39 (1), 89 (2020).
- Liu, C. C., Steen, C. B., Newman, A. M. Computational approaches for characterizing the tumor immune microenvironment. Immunology. 158 (2), 70-84 (2019).
- Eisenstein, M. Cell sorting: Divide and conquer. Nature. 441 (7097), 1179-1185 (2006).
- Scognamiglio, G., et al. Multiplex immunohistochemistry assay to evaluate the melanoma tumor microenvironment. Methods in Enzymology. 635, 21-31 (2020).
- Guo, N., et al. A 34-marker panel for imaging mass cytometric analysis of human snap-frozen tissue. Frontiers in Immunology. 11, 1466 (2020).
- Fu, T., et al. Spatial architecture of the immune microenvironment orchestrates tumor immunity and therapeutic response. Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 98 (2021).
- Rost, S., et al. Multiplexed ion beam imaging analysis for quantitation of protein expresssion in cancer tissue sections. Laboratory Investigation. 97 (8), 992-1003 (2017).
- Keren, L., et al. A structured tumor-immune microenvironment in triple negative breast cancer revealed by multiplexed ion beam imaging. Cell. 174 (6), 1373-1387 (2018).
- Mathieson, W., Thomas, G. A. Why formalin-fixed, paraffin-embedded biospecimens must be used in genomic medicine: An evidence-based review and conclusion. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 68 (8), 543-552 (2020).
- Baghban, R., et al. Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 59 (2020).
- Cai, S., Allam, M., Coskun, A. F. Multiplex spatial bioimaging for combination therapy design. Trends in Cancer. 6 (10), 813-818 (2020).
- Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics. NPJ Precision Oncology. 4, 11 (2020).
- Rad, H. S., et al. The Pandora’s box of novel technologies that may revolutionize lung cancer. Lung Cancer. 159, 34-41 (2021).
- Tan, W. C. C., et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Commununications. 40 (4), 135-153 (2020).
- Ptacek, J., et al. Multiplexed ion beam imaging (MIBI) for characterization of the tumor microenvironment across tumor types. Laboratory Investigation. 100 (8), 1111-1123 (2020).
