Formalin-Sabit ve Parafin-Gömülü Doku Örneklerinin Kütle Spektrometrisi Görüntülemesini Kullanarak Tümör Mikroçevresinin Kavranmasının Genişletilmesi
Summary
Kanser immünoterapisi çağında, tümör mikroçevre dinamiklerini aydınlatmaya olan ilgi çarpıcı bir şekilde artmıştır. Bu protokol, boyama ve görüntüleme adımlarıyla ilgili olarak kütle spektrometresi görüntüleme tekniğini detaylandırır ve bu da oldukça çoklanmış mekansal analize izin verir.
Abstract
Bağışıklık temelli tedavilerdeki ilerlemeler, kanser tedavisi ve araştırmalarında devrim yaratmıştır. Bu, tümör bağışıklık manzarasının karakterizasyonu için artan talebi tetiklemiştir. Standart immünohistokimya doku mimarisini incelemek için uygun olmasına rağmen, az sayıda belirtecin analizi ile sınırlıdır. Tersine, akış sitometrisi gibi teknikler, doku morfolojisi hakkında bilgi kaybolmasına rağmen, aynı anda birden fazla belirteci değerlendirebilir. Son yıllarda, fenotipik ve mekansal analizi bütünleştiren çoklanmış stratejiler, tümör immün manzarasının karakterizasyonuna kapsamlı yaklaşımlar olarak ortaya çıkmıştır. Burada, metal etiketli antikorları ve ikincil iyon kütle spektrometresini birleştiren, tahlil geliştirme ve optimizasyonu, doku hazırlama ve görüntü toplama ve işlemedeki teknik adımlara odaklanan yenilikçi bir teknolojiyi tartışıyoruz. Boyama işleminden önce, metal etiketli bir antikor paneli geliştirilmeli ve optimize edilmelidir. Bu hi-plex görüntü sistemi, tek bir doku bölümünde 40 adede kadar metal etiketli antikoru destekler. Not olarak, sinyal paraziti riski, panele dahil edilen işaretleyicilerin sayısıyla birlikte artar. Panel tasarımından sonra, bu paraziti en aza indirmek için antikora metal izotop atanmasına özellikle dikkat edilmelidir. Ön panel testi, küçük bir antikor alt kümesi kullanılarak ve ardından tüm panelin kontrol dokularında test edilmesi kullanılarak gerçekleştirilir. Formalin sabit, parafin gömülü doku kesitleri elde edilir ve altın kaplı slaytlara monte edilir ve daha fazla boyanır. Boyama 2 gün sürer ve standart immünohistokimyasal boyamaya çok benzer. Numuneler lekelendikten sonra, görüntü alma cihazına yerleştirilir. Görünüm alanları seçilir ve görüntüler alınır, karşıya yüklenir ve depolanır. Son aşama, sistemin görüntü işleme yazılımını kullanarak parazitin filtrelenmesi ve giderilmesi için görüntü hazırlamadır. Bu platformun bir dezavantajı, analitik yazılım eksikliğidir. Bununla birlikte, üretilen görüntüler farklı hesaplamalı patoloji yazılımları tarafından desteklenmektedir.
Introduction
Klonal tümör popülasyonlarını çevreleyen çok sayıda hücre tipinin önemi, karsinogenezin kategorizasyonunda çok önemli bir unsurdur. Bu tümör mikroçevre (TME) kompozisyonunu ve etkileşimlerini aydınlatmaya olan ilgi, kanser tedavisi cephaneliğinin bir parçası olarak bağışıklık temelli tedavinin kurulmasını takiben sürekli artmıştır. Bu nedenle, tedavi stratejileri tümör merkezli bir yaklaşımdan TME merkezli bir yaklaşıma kaymıştır1.
Bağışıklık hücrelerinin tümör sürveyansı ve kanser gelişimindeki rollerini aydınlatma çabaları son yıllarda çarpıcı bir şekilde artmıştır 2,3. Tıbbi araştırmalarda, sitometri tabanlı yöntemler ve singleplex ve multipleks görüntüleme teknolojileri de dahil olmak üzere çok sayıda yöntem, TME’lerin çoklu elemanlarının benzersiz etkileşimlerini deşifre etme girişiminin bir parçası olarak ortaya çıkmıştır.
Akış sitometrisi (1960’larda icat edildi), floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama ve kütle sitometrisi gibi öncü yöntemler esas olarak TME bileşenlerini tanımlamaya ve ölçmeye odaklanmıştır4. Sitometriye dayalı kantitatif teknikler immün peyzaj fenotiplemesine izin verse de, hücresel uzamsal dağılımın belirlenmesi imkansızdır. Tersine, standart singleplex immünohistokimyası gibi yöntemler doku mimarisini korur ve araştırmacıların hücresel dağılımı analiz etmelerini sağlar, ancak tek bir doku bölümünde daha az sayıda hedef bu yöntemlerin bir sınırlamasıdır 5,6. Son birkaç yılda, multipleks immünofloresan, barkodlamalı floresan görüntüleme ve görüntüleme kütle spektrometrisi gibi tek hücreli çözünürlük için çoklanmış görüntüleme teknolojileri, aynı doku bölüm7’yi kullanarak eşzamanlı belirteç boyama hakkında bilgi edinmek için kapsamlı stratejiler olarak ortaya çıkmıştır.
Burada, metal etiketli antikorları ve ikincil iyon kütle spektrometrisini birleştiren ve tek hücreli çözünürlük ölçümü, işaretleyici ko-ekspresyonu (fenotipleme) ve formalin sabit, parafin gömülü (FFPE) ve taze dondurulmuş (FF) doku örnekleri 8,9 kullanılarak mekansal analiz sağlayan bir teknoloji sunuyoruz. FFPE örnekleri, doku arşivleme örnekleri için en yaygın kullanılan malzemelerdir ve çoğaltılmış görüntüleme teknolojileri için taze dondurulmuş örneklerden daha kolay erişilebilir bir kaynağı temsil eder10. Ek olarak, bu teknoloji aylar sonra görüntüleri yeniden elde etme imkanı sunar. Burada, FFPE doku örneklerini kullanarak boyama ve görüntü işleme protokollerimizi tartışıyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bir TME’nin çoklu bileşenleri arasındaki karmaşık, karmaşık etkileşimlerin kapsamlı bir şekilde aydınlatılması, kanser araştırmalarının önemli bir amacı olmaya devam etmektedir. Üreticiler, özellikle son 5 yılda, bu çabanın bir parçası olarak çok sayıda çoklanmış tahlil başlattılar. Çok katlı mekansal analiz, tümör örneklerinde yapısal morfolojiyi korurken birkaç hedefin eşzamanlı kategorizasyonunu kolaylaştıran çok yönlü ve güçlü bir araçtır. Mekansal analiz teknikleri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, bu makaleyi düzenlediği için Düzenleme Hizmetleri, MD Anderson’daki Araştırma Tıp Kütüphanesi ve MD Anderson’daki Translasyonel Moleküler Patoloji Bölümü’ndeki Multipleks İmmünofloresan ve Görüntü Analizi Laboratuvarı’ndan Don Norwood’a teşekkür etmektedir. Bu yayın kısmen, Ulusal Kanser Enstitüsü (NCI) İşbirliği Anlaşması (U24CA224285) aracılığıyla Teksas Üniversitesi MD Anderson Kanser Merkezi Kanser İmmün İzleme ve Analiz Merkezi’ne (CIMAC) sağlanan Kanser İmmünolojik Veri Müşterekleri Ağı’na (CIMAC-CIDC) bilimsel ve finansal desteğin kolaylaştırdığı araştırmalardan kaynaklanmıştır.
Materials
| 100% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R8382 | |
| 95% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R3404 | |
| 80% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R3279 | |
| 70% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R315 | |
| 20X TBS-T | Ionpath | 567005 | |
| 10X Low-Barium PBS pH 7.4 | Ionpath | 567004 | |
| 10X Tris pH 8.5 | Ionpath | 567003 | |
| 4°C Refrigerator | ThermoScientific | REVCO | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P10 | Olympus | 24-401 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P20 | Olympus | 24-404 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P200 | Olympus | 24-412 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P1000 | Olympus | 24-430 | |
| Centrifugal Filter Ultrafree-MC | Fisher Scientific | UFC30VV00 | |
| Deionized H2O | Ionpath | 567002 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| EasyDip Slide Staining Jar, Green | Electron Microscopy Sciences | 71385-G | |
| EasyDip Slide Staining Jar, Yellow | Electron Microscopy Sciences | 71385-Y | |
| EasyDip Slide Staining Kit (Jar+Rack), White | Electron Microscopy Sciences | 71388-01 | |
| EasyDip Stainless Steel Holder | Electron Microscopy Sciences | 71388-50 | |
| Glutaraldehyde 70% EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 16360 | |
| Heat Induced Epitope Retrieval (HIER) buffer: 10X Tris with EDTA, pH 9 | Dako | S2367 | |
| Heat resistant slide chamber | Electron Microscopy Sciences | 62705-01 | |
| Hydrophobic barrier pen | Fisher | 50-550-221 | |
| MIBI/O software | Ionpath | NA | |
| MIBIcontrol software | Ionpath | NA | |
| MIBIslide | Ionpath | 567001 | |
| MIBIscope | Ionpath | NA | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Moisture Chamber (Humid Chamber) | Simport | M922-1 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets | Fisher Scientific | BP2944100 | |
| PT Module | Thermo Scientific | A80400012 | |
| Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units | Fisher Scientific | 097403A | |
| Shaker | BioRocker | S2025 | |
| Spin column (Ultrafree-MC Spin Filter, 0.5mL 0.1μm ) | MillQ | UFC30VV00 | |
| Slide oven | Fisher Scientific | 6901 | |
| Vaccum Cabinet Desiccator | VWR | 30621-076 | |
| Task-whipe | Kimberly Clark | 34155 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056-4L |
References
- Laplane, L., Duluc, D., Bikfalvi, A., Larmonier, N., Pradeu, T. Beyond the tumour microenvironment. International Journal of Cancer. 145 (10), 2611-2618 (2019).
- Galli, F., et al. Relevance of immune cell and tumor microenvironment imaging in the new era of immunotherapy. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 39 (1), 89 (2020).
- Liu, C. C., Steen, C. B., Newman, A. M. Computational approaches for characterizing the tumor immune microenvironment. Immunology. 158 (2), 70-84 (2019).
- Eisenstein, M. Cell sorting: Divide and conquer. Nature. 441 (7097), 1179-1185 (2006).
- Scognamiglio, G., et al. Multiplex immunohistochemistry assay to evaluate the melanoma tumor microenvironment. Methods in Enzymology. 635, 21-31 (2020).
- Guo, N., et al. A 34-marker panel for imaging mass cytometric analysis of human snap-frozen tissue. Frontiers in Immunology. 11, 1466 (2020).
- Fu, T., et al. Spatial architecture of the immune microenvironment orchestrates tumor immunity and therapeutic response. Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 98 (2021).
- Rost, S., et al. Multiplexed ion beam imaging analysis for quantitation of protein expresssion in cancer tissue sections. Laboratory Investigation. 97 (8), 992-1003 (2017).
- Keren, L., et al. A structured tumor-immune microenvironment in triple negative breast cancer revealed by multiplexed ion beam imaging. Cell. 174 (6), 1373-1387 (2018).
- Mathieson, W., Thomas, G. A. Why formalin-fixed, paraffin-embedded biospecimens must be used in genomic medicine: An evidence-based review and conclusion. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 68 (8), 543-552 (2020).
- Baghban, R., et al. Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 59 (2020).
- Cai, S., Allam, M., Coskun, A. F. Multiplex spatial bioimaging for combination therapy design. Trends in Cancer. 6 (10), 813-818 (2020).
- Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics. NPJ Precision Oncology. 4, 11 (2020).
- Rad, H. S., et al. The Pandora’s box of novel technologies that may revolutionize lung cancer. Lung Cancer. 159, 34-41 (2021).
- Tan, W. C. C., et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Commununications. 40 (4), 135-153 (2020).
- Ptacek, J., et al. Multiplexed ion beam imaging (MIBI) for characterization of the tumor microenvironment across tumor types. Laboratory Investigation. 100 (8), 1111-1123 (2020).
