Élargir la compréhension du microenvironnement tumoral à l’aide de l’imagerie par spectrométrie de masse d’échantillons de tissus fixés au formol et incorporés à la paraffine
Summary
À l’ère de l’immunothérapie du cancer, l’intérêt pour l’élucidation de la dynamique du microenvironnement tumoral a augmenté de manière frappante. Ce protocole détaille une technique d’imagerie par spectrométrie de masse en ce qui concerne ses étapes de coloration et d’imagerie, qui permettent une analyse spatiale hautement multiplexée.
Abstract
Les progrès des thérapies immunitaires ont révolutionné le traitement et la recherche sur le cancer. Cela a déclenché une demande croissante pour la caractérisation du paysage immunitaire tumoral. Bien que l’immunohistochimie standard soit adaptée à l’étude de l’architecture tissulaire, elle se limite à l’analyse d’un petit nombre de marqueurs. Inversement, des techniques telles que la cytométrie en flux peuvent évaluer plusieurs marqueurs simultanément, bien que les informations sur la morphologie des tissus soient perdues. Au cours des dernières années, les stratégies multiplexées qui intègrent l’analyse phénotypique et spatiale ont émergé comme des approches globales pour la caractérisation du paysage immunitaire tumoral. Ici, nous discutons d’une technologie innovante combinant des anticorps marqués par des métaux et la spectrométrie de masse d’ions secondaires en se concentrant sur les étapes techniques du développement et de l’optimisation des tests, de la préparation des tissus, ainsi que de l’acquisition et du traitement des images. Avant la coloration, un panel d’anticorps marqués en métal doit être développé et optimisé. Ce système d’image hi-plex prend en charge jusqu’à 40 anticorps marqués au métal dans une seule section de tissu. Il convient de noter que le risque d’interférence du signal augmente avec le nombre de marqueurs inclus dans le panneau. Après la conception du panel, une attention particulière doit être accordée à l’affectation de l’isotope métallique à l’anticorps afin de minimiser cette interférence. Les tests préliminaires par panel sont effectués à l’aide d’un petit sous-ensemble d’anticorps et les tests ultérieurs de l’ensemble du panel dans les tissus témoins. Des coupes de tissu fixées au formol et incorporées à la paraffine sont obtenues et montées sur des lames recouvertes d’or et tachées davantage. La coloration prend 2 jours et ressemble beaucoup à la coloration immunohistochimique standard. Une fois les échantillons colorés, ils sont placés dans l’instrument d’acquisition d’images. Les champs de vision sont sélectionnés et les images sont acquises, téléchargées et stockées. La dernière étape est la préparation de l’image pour le filtrage et la suppression des interférences à l’aide du logiciel de traitement d’image du système. Un inconvénient de cette plate-forme est le manque de logiciels analytiques. Cependant, les images générées sont prises en charge par différents logiciels de pathologie computationnelle.
Introduction
L’importance des nombreux types de cellules entourant les populations de tumeurs clonales est un élément crucial dans la catégorisation de la cancérogenèse. L’intérêt pour l’élucidation de la composition et des interactions de ce microenvironnement tumoral (TME) n’a cessé d’augmenter après la mise en place d’une thérapie immunitaire dans le cadre de l’arsenal de traitement du cancer. Par conséquent, les stratégies de traitement sont passées d’une approche centrée sur la tumeur à une approche centrée sur le TME1.
Les efforts visant à élucider les rôles des cellules immunitaires dans la surveillance tumorale et le développement du cancer se sont multipliés de façon frappante ces dernières années 2,3. Dans la recherche médicale, une pléthore de méthodes, y compris des méthodes basées sur la cytométrie et des technologies d’imagerie singleplex et multiplex, sont apparues dans le cadre de cette tentative de déchiffrer les interactions uniques de multiples éléments des ETM.
Des méthodes pionnières telles que la cytométrie en flux (inventée dans les années 1960), le tri cellulaire activé par fluorescence et la cytométrie de masse se concentrent principalement sur l’identification et la quantification des composants du TME4. Même si les techniques quantitatives basées sur la cytométrie permettent le phénotypage du paysage immunitaire, la détermination de la distribution spatiale cellulaire est impossible. Inversement, des méthodes telles que l’immunohistochimie singleplex standard préservent l’architecture tissulaire et permettent aux chercheurs d’analyser la distribution cellulaire, bien qu’un nombre réduit de cibles dans une seule section tissulaire soit une limitation de ces méthodes 5,6. Au cours des dernières années, les technologies d’imagerie multiplexées pour la résolution unicellulaire, telles que l’immunofluorescence multiplexe, l’imagerie par fluorescence à code-barres et la spectrométrie de masse par imagerie, sont apparues comme des stratégies complètes pour acquérir des informations sur la coloration simultanée des marqueurs à l’aide de la même sectionde tissu 7.
Nous présentons ici une technologie qui associe des anticorps marqués par des métaux et la spectrométrie de masse d’ions secondaires et permet la quantification de la résolution unicellulaire, la co-expression de marqueurs (phénotypage) et l’analyse spatiale à l’aide d’échantillons de tissus fixés au formol, incorporés à la paraffine (FFPE) et frais congelés (FF) 8,9. Les échantillons FFPE sont les matériaux les plus largement utilisés pour l’archivage des échantillons tissulaires et représentent une ressource plus facilement disponible pour les technologies d’imagerie multiplexée que les échantillons frais congelés10. De plus, cette technologie offre la possibilité de réacquérir des images des mois après. Ici, nous discutons de nos protocoles de coloration et de traitement d’image utilisant des échantillons de tissus FFPE.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’élucidation complète des interactions complexes et complexes entre les multiples composantes d’un ETM demeure un objectif central de la recherche sur le cancer. Les fabricants ont introduit de nombreux tests multiplexés dans le cadre de cet effort, en particulier au cours des 5 dernières années. L’analyse spatiale multiplexée est un outil polyvalent et puissant qui facilite la catégorisation simultanée de plusieurs cibles tout en préservant la morphologie structurelle dans les échantillons tumoraux. Les…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Don Norwood de Editing Services, Research Medical Library at MD Anderson pour la rédaction de cet article et le Multiplex Immunofluorescence and Image Analysis Laboratory du Département de pathologie moléculaire translationnelle de MD Anderson. Cette publication résulte en partie de la recherche facilitée par le soutien scientifique et financier du Cancer Immune Monitoring and Analysis Centers-Cancer Immunologic Data Commons Network (CIMAC-CIDC) fourni dans le cadre de l’accord de coopération du National Cancer Institute (NCI) (U24CA224285) au Centre de surveillance et d’analyse immunitaire du cancer MD Anderson Cancer Center (CIMAC) de l’Université du Texas.
Materials
| 100% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R8382 | |
| 95% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R3404 | |
| 80% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R3279 | |
| 70% Reagent Alcohol | Sigma-Aldrich | R315 | |
| 20X TBS-T | Ionpath | 567005 | |
| 10X Low-Barium PBS pH 7.4 | Ionpath | 567004 | |
| 10X Tris pH 8.5 | Ionpath | 567003 | |
| 4°C Refrigerator | ThermoScientific | REVCO | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P10 | Olympus | 24-401 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P20 | Olympus | 24-404 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P200 | Olympus | 24-412 | |
| Aerosol Barrier Pipette Tips P1000 | Olympus | 24-430 | |
| Centrifugal Filter Ultrafree-MC | Fisher Scientific | UFC30VV00 | |
| Deionized H2O | Ionpath | 567002 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| EasyDip Slide Staining Jar, Green | Electron Microscopy Sciences | 71385-G | |
| EasyDip Slide Staining Jar, Yellow | Electron Microscopy Sciences | 71385-Y | |
| EasyDip Slide Staining Kit (Jar+Rack), White | Electron Microscopy Sciences | 71388-01 | |
| EasyDip Stainless Steel Holder | Electron Microscopy Sciences | 71388-50 | |
| Glutaraldehyde 70% EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 16360 | |
| Heat Induced Epitope Retrieval (HIER) buffer: 10X Tris with EDTA, pH 9 | Dako | S2367 | |
| Heat resistant slide chamber | Electron Microscopy Sciences | 62705-01 | |
| Hydrophobic barrier pen | Fisher | 50-550-221 | |
| MIBI/O software | Ionpath | NA | |
| MIBIcontrol software | Ionpath | NA | |
| MIBIslide | Ionpath | 567001 | |
| MIBIscope | Ionpath | NA | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Moisture Chamber (Humid Chamber) | Simport | M922-1 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets | Fisher Scientific | BP2944100 | |
| PT Module | Thermo Scientific | A80400012 | |
| Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units | Fisher Scientific | 097403A | |
| Shaker | BioRocker | S2025 | |
| Spin column (Ultrafree-MC Spin Filter, 0.5mL 0.1μm ) | MillQ | UFC30VV00 | |
| Slide oven | Fisher Scientific | 6901 | |
| Vaccum Cabinet Desiccator | VWR | 30621-076 | |
| Task-whipe | Kimberly Clark | 34155 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056-4L |
References
- Laplane, L., Duluc, D., Bikfalvi, A., Larmonier, N., Pradeu, T. Beyond the tumour microenvironment. International Journal of Cancer. 145 (10), 2611-2618 (2019).
- Galli, F., et al. Relevance of immune cell and tumor microenvironment imaging in the new era of immunotherapy. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 39 (1), 89 (2020).
- Liu, C. C., Steen, C. B., Newman, A. M. Computational approaches for characterizing the tumor immune microenvironment. Immunology. 158 (2), 70-84 (2019).
- Eisenstein, M. Cell sorting: Divide and conquer. Nature. 441 (7097), 1179-1185 (2006).
- Scognamiglio, G., et al. Multiplex immunohistochemistry assay to evaluate the melanoma tumor microenvironment. Methods in Enzymology. 635, 21-31 (2020).
- Guo, N., et al. A 34-marker panel for imaging mass cytometric analysis of human snap-frozen tissue. Frontiers in Immunology. 11, 1466 (2020).
- Fu, T., et al. Spatial architecture of the immune microenvironment orchestrates tumor immunity and therapeutic response. Journal of Hematology & Oncology. 14 (1), 98 (2021).
- Rost, S., et al. Multiplexed ion beam imaging analysis for quantitation of protein expresssion in cancer tissue sections. Laboratory Investigation. 97 (8), 992-1003 (2017).
- Keren, L., et al. A structured tumor-immune microenvironment in triple negative breast cancer revealed by multiplexed ion beam imaging. Cell. 174 (6), 1373-1387 (2018).
- Mathieson, W., Thomas, G. A. Why formalin-fixed, paraffin-embedded biospecimens must be used in genomic medicine: An evidence-based review and conclusion. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 68 (8), 543-552 (2020).
- Baghban, R., et al. Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 59 (2020).
- Cai, S., Allam, M., Coskun, A. F. Multiplex spatial bioimaging for combination therapy design. Trends in Cancer. 6 (10), 813-818 (2020).
- Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics. NPJ Precision Oncology. 4, 11 (2020).
- Rad, H. S., et al. The Pandora’s box of novel technologies that may revolutionize lung cancer. Lung Cancer. 159, 34-41 (2021).
- Tan, W. C. C., et al. Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy. Cancer Commununications. 40 (4), 135-153 (2020).
- Ptacek, J., et al. Multiplexed ion beam imaging (MIBI) for characterization of the tumor microenvironment across tumor types. Laboratory Investigation. 100 (8), 1111-1123 (2020).
