Den senaste generationen av EV-karakteriseringsverktyg kan utföra en enda EV-analys över flera parametrar samtidigt. Nanoflödescytometri mäter alla biologiska partiklar större än 45 nm utan märkning och identifierar specifika egenskaper hos delpopulationer med en mängd olika fluorescerande märkningstekniker.
Karakterisering av enstaka partiklar har blivit alltmer relevant för forskning om extracellulära vesiklar, som går från bulkanalystekniker och första generationens partikelanalys till omfattande multiparametermätningar som nanoflödescytometri (nFCM). nFCM är en form av flödescytometri som använder instrumentering speciellt utformad för nanopartikelanalys, vilket gör att tusentals elbilar kan karakteriseras per minut både med och utan användning av färgningstekniker. Detektering av högupplöst sidospridning (SS) gör det möjligt att bestämma storlek och koncentration för alla biologiska partiklar större än 45 nm, medan samtidig fluorescensdetektering (FL) identifierar närvaron av märkta markörer och mål av intresse. Märkta delpopulationer kan sedan beskrivas i kvantitativa enheter av partiklar/ml eller som en procentandel av de totala partiklar som identifieras med sidospridning.
Här är elbilar härledda från konditionerade cellodlingsmedier (CCM) märkta med både ett lipidfärgämne för att identifiera partiklar med ett membran och antikroppar som är specifika för CD9, CD63 och CD81 som vanliga EV-markörer. Mätningar av jämförelsematerial, en koncentrationsstandard och en storleksstandard för kiseldioxidnanosfärer samt märkt provmaterial analyseras i en 1-minuters analys. Programvaran används sedan för att mäta koncentrationen och storleksfördelningsprofilen för alla partiklar, oberoende av märkning, innan man bestämmer partiklarna som är positiva för var och en av etiketterna.
Samtidig SS- och FL-detektering kan användas flexibelt med många olika EV-källor och märkningsmål, både externa och interna, som beskriver EV-prover på ett omfattande och kvantitativt sätt.
Vad är elbilar?
Extracellulära vesiklar (EV) är samlingsbegreppet för en rad cell-härledda membranösa partiklar som är integrerade i många normala cell- och vävnadsaktiviteter. Deras inverkan på ett brett spektrum av vetenskapliga områden och deras potentiella kliniska relevans har drivit en tillväxt inom EV-forskning och industriellt intresse1. Liten EV (sEV) forskning fokuserar främst på exosomer, 40-100 nm partiklar som börjar bildas i de tidiga endosomerna före mognad och frigörs genom fusion av multi-vesikulära kroppar (MVB) till plasmamembranet, samt mikrovesiklar, som knoppar direkt från plasmamembranet och bildar 80-1 000 nm partiklar2. En tredje EV-population är apoptotiska kroppar, 50-1,500 nm partiklar bildade under celldöd, vilket innebär att deras relativa andel till andra elbilar kan vara mycket varierande3.
Eftersom EV-egenskaper kan representera förändringar som inträffar i deras cell / ursprungsvävnad, finns det potential för deras användning i diagnostik. Olika “omics” -analyser har börjat identifiera markörer för cellursprung och sjukdomstillstånd, vilket kan möjliggöra icke-invasiv bedömning av patienter som använder EV-källor som blodplasma / serum, urin, saliv och cerebral ryggmärgsvätska (CSF) 4,5. En drivkraft bakom dessa EV-relaterade innovationer är nya karakteriseringstekniker som övervinner tidigare begränsningar.
Behovet av, och utmaningarna med, karakterisering av enstaka elbilar
Single EV-karakterisering blir allt viktigare för både validering och beskrivning av EV-isolat, samt för att belysa nyckelfunktioner hos dessa nanopartiklar för progression av EV-baserade terapier och diagnostik6. Beroende på EV-källa och avsedd användning kan analys av renhet, som ofta beskrivs som ett förhållande mellan EV och icke-EV-partiklar eller som EV till fritt protein, kräva betydande mängder data från flera analyser7.
Partikelräkning och storleksmätningar i EV-publikationer har tidigare förlitat sig starkt på nanopartikelspårning (NTA), resistiv pulsavkänning (RPS) och elektronmikroskopi (EM)2. Standard NTA och RPS saknar förmågan att skilja elbilar från icke-EV-partiklar och har sina egna försiktighetsåtgärder som långsam genomströmning8 och olämplig nedre detektionsgräns sett med NTA 9,10,11.
Tetraspaninerna CD9, CD63 och CD81 har historiskt sett varit viktiga identifierare för förekomsten av elbilar i EV-isoleringar/förberedelser. Vanligtvis används western blotting (WB) och dot blotting-tekniker för att visa anrikningen av dessa proteiner i EV-isolat jämfört med celllysat12. Bristen på kvantifiering av dessa metoder och heterogeniteten hos dessa EV-markörer, avseende både visning inom EV-subpopulationer och cell-, vävnads- eller patientrelaterad variation, uppmuntrar emellertid avancerade analytiska tekniker som förenar fysisk och fenotypisk karakterisering13.
Nanoflödescytometri som en omfattande EV-analysteknik
För att bestämma sanna EV-koncentrationer krävs identifiering av intakta partiklar och en universell markör, särskilt i komplexa partikelisolat, med upplösning som kan detektera alla elbilar samtidigt som de skiljer dem från icke-EV-partiklar14.
Nanoflödescytometri (nFCM) är en teknik som möjliggör omärkt analys av partiklar som är stora mellan 45-1 000 nm samtidigt som fluorescerande märkning och detektion används för att identifiera partikelunderpopulationer. En viktig skillnad från konventionell flödescytometri är användningen av utrustning avsedd för nanopartikelanalys, vilket möjliggör den största upplösningen15. EV-analys, som använder konventionell flödesinstrumentation som återanvänds för analys av små partiklar, förbättras, men kämpar fortfarande för att uppnå upplösningen för att upptäcka och analysera <100 nm elbilar16,17. Pärlbaserad flödescytometri är en ytterligare anpassning som ofta används för EV-analys, men detta tar bort möjligheten till detektering av enstaka partiklar och introducerar fångstbaserade fördomar18.
Genom att dra nytta av en lägre detektionsgräns på ~ 45 nm i sidospridningskanalen (SS) för EV-analys, använder nFCM SS-utlösning. Detta kan ses som “partikel först” -analys eftersom det betyder att händelser måste ge en SS-signal som överskrider en inställd tröskel före analys av fluorescensintensiteten. Detta tar bort falska positiva resultat som nedbrutet membran och fluoroforaggregeringar och fokuserar analysen på intakta elbilar15. SS-mätningar används också för att dimensionera enskilda partiklar genom jämförelse med en fyrmodal kiseldioxidnanosfärstandard19. Fluorescensmätningarna görs på ytterligare två detektorer som möjliggör tre samtidiga mätningar för varje partikel för att beskriva partikelkoncentration, storlekar och närvaro av markörer eller andra mål av intresse för att identifiera EV-delpopulationer20.
I följande experiment används SS- och fluorescerande (FL) mätningar för att mäta >45 nm partiklar, visa delmängden membranpositiva elbilar och identifiera CD9, CD63, CD81-presentation på EV-delpopulationer. Både koncentrationen av dessa delpopulationer och deras förhållande som en del av de totala partiklarna uppmätta med SS beskrivs, liksom deras storleksprofiler.
Prov- och reagensdetaljer
Två EV-isolat från separata cellinjer valdes för demonstration av fluorescerande märkning och efterföljande nFCM-analys. Båda EV-uppsättningarna hängdes upp i PBS och lagrades vid -80 ° C i <3 månader men de flesta andra förhållanden skilde sig åt mellan isolat. C2C12-musmyoblastcellinjen representerar en embryonal föregångare till skelettmuskelceller och odlades i 2D-odling och konditionerade tillväxtmediet över 72 timmar före EV-isolering genom ultracentrifugering. SW620 är en human kolon adenokarcinom cellinje och odlades i en rudimentär bioreaktor, berikande media under 7 veckor, med EV-isolering utförd av storleksuteslutningskromatografi (SEC) och fraktioner 7-9 eluterade från seferos CL-2B-kolumner kombinerade till ett enda prov.
Medan elbilar isolerade och koncentrerade från CCM är de enklaste provtyperna att arbeta med, är nFCM tillämpligt på de flesta EV-isolat, inklusive biofluider som serum, plasma, urin och CSF. Dessa provanalyser drar nytta av nFCM SS-detektionen av alla partiklar, vilket möjliggör bekräftelse med NTA, TRPS och andra partikelanalyser, samtidigt som de fluorescerande märkta EV-delpopulationerna beskrivs i kvantitativa termer samt en andel av totalen, för ett opartiskt tillvägagångssätt för multiparameterpartikelanalys. Analys av lågbearbetade prover är också möjlig, såsom oklargjord urin och EV-berikad CCM med förbehållet att kräva lågt förorenat protein.
Membranfärgämnet som används här är avsett att integreras i lipid-dubbelskiktet, med en lipofil enhet för membranbelastning och ett hydrofilt färgämne för kvarstående i plasmamembranet25. Det finns för närvarande inget perfekt EV-märkningsfärgämne och flera kriterier måste beaktas vid valet, inklusive specificitet för elbilar, lämplighet med fixering eller permeabilisering och effektivitet för EV-märkning26.
Fluorescerande konjugerad antikroppsmärkning av ytexponerade epitoper har visat sig vara en effektiv metod för att identifiera EV-delpopulationer27. En viktig aspekt av protokolloptimering är att uppfylla, och inte överskrida, märkningsmättnadspunkten för att binda till alla tillgängliga epitoper utan att hämma detektion av partiklar med låg fluorescens genom att låta den omgivande bufferten fyllas med fluorescerande obunden antikropp28. Dessutom påverkas tillgängligheten av exponerade bindningsställen för antikroppsmärkning potentiellt av flera faktorer. Lagringsförhållanden för elbilar har visat sig påverka koncentrations- och storleksprofiler för elbilar29 med observationer som också indikerar effekter på antikroppsmärkning30. Närvaron av ytkoronaproteiner, proteinmodifieringar och effekter av isoleringstekniker kan också ha effekter på antikroppsmärkning i vissa fall. I slutändan, när användningen av fluorescerande märkning blir vanligare för EV-studier, kommer experimentell design och optimering för flera analytiska tekniker att bli mer förfinad.
För att öka noggrannheten i resultaten kan flera kontroller inkluderas, såsom (1) PBS + färgämneskontroll, för att bedöma micell- eller aggregatbildning i vissa färgämnen, som kan visas som SS + partiklar i nFCM-analys, (2) PBS + antikroppskontroll, aggregat kan förekomma, även om de ofta inte är tillräckligt stora för att sprida tillräckligt med ljus för SS-detektion, (3) EV-prov + IgG-antikroppskontroll, vanligt i flödescytometri och används för att identifiera någon icke-specifik bindning, (4) icke-EV-partikelprov + antikropps- / färgämneskontroll – särskilt viktigt när man behöver identifiera elbilar i komplexa partikelprover, kontroller som renade LDL-partiklar (low-density lipoprotein) eller EV-utarmade / ablerade prover kan fungera som en negativ kontroll för att validera selektiv märkning, (5) positiva kontroller är svåra att designa men validering av en antikropp på celler är en användbar inkludering.
Presentation av tetraspaniner på elbilar
Antikropps- och membranmärkningen av detta experiment visar den höga nivån av kvantitativa data som kan erhållas inom en liten tidsram genom nFCM-analys. Samtidig mätning av de viktigaste fysiska egenskaperna hos partikeldiameter/koncentration med fenotypiska mätningar av membran- och/eller proteinnärvaro leder till högnivåbeskrivningar av subpopulationer inom partikelisolering.
Viktigt är att varierande nivåer av de tre “viktiga” EV-relaterade tetraspaninerna, CD9, CD63, CD81, identifierades i dessa två EV-prover. CD9 presenterades på den största andelen elbilar för både C2C12-härledda elbilar och SW620, där CD81 och CD63 var de andra respektive minst presenterade proteinerna.
Trots vissa likheter som observerats här i tetraspaninprofilerna för elbilar från två mycket olika cellkällor kan nivåerna av CD9, CD63 och CD81 vara mycket olika mellan cellinje och patienthärledda elbilar31.
Skillnaden i CD63-uttryck mellan de två EV-proverna är särskilt relevant för den pågående diskussionen om nyckelidentifierare för “EV-ness”. Medan presentation av CD63 i endast ~ 8% av SW620-elbilarna kan vara oväntad av vissa, har CD63 föreslagits som dålig identifierare för de olika typerna av elbilar isolerade efter storlek eller densitet32, och tetraspaninnegativa elbilar har identifierats, även när de beskrivs som exosomliknande33.
Identifiering av elbilar inom komplexa partikelisoleringar
Heterogeniteten hos EV-tetraspaninprofiler, i både cellinjer och patient-härledda elbilar, varnar för beroende av tetraspaninbaserad infångning av elbilar och belyser det framtida behovet av nya EV-identifieringsmetoder31. EV-märkning oberoende av specifika proteiner kan visa sig vara mycket fördelaktigt för att identifiera elbilar från liknande storlekar som inte är EV-partiklar om EV-specificitet kan bevisas vara mycket hög. Detta gäller särskilt för biofluid EV-isolat eftersom det har föreslagits att koncentrationen av elbilar i humant blodplasma ligger i intervallet 10 10 partiklar / ml medan lipoproteiner mäts till10 16 per ml14,34. Även vid EV-anrikning föreslår studier som jämför partikelpositivitet för tetraspaninmarkörer och / eller LDL-markör ApoB ~ 50-100 gånger större överflöd av LDL i trombocytfria plasmaprover (PFP) jämfört med EV35.
Isoleringstekniken som används påverkar i hög grad utbudet av samisolerade icke-EV-partiklar såsom lipoproteiner med mycket låg densitet (VLDL), lipoproteiner med mellanliggande densitet (IDL) och LDL36. Det finns också beskrivningar av lipoprotein-co-isolat bundna till elbilar som, även om de potentiellt spelar en viktig biologisk roll, gör att uppnå EV-rena prover till ett utmanande mål35.
Det skulle därför kunna hävdas att större fokus läggs på beskrivningen av partiklar som utgör ett prov, snarare än att uppnå isolering av ett rent men begränsat urval av elbilar. Att uppnå en omfattande beskrivning av partiklar genom att mäta tetraspaninförekomst i bulk och partikelantal separat kan vara otillräckligt för att exakt bestämma EV-koncentrationer, särskilt från biofluidkällor36,37. Att identifiera delpopulationer i ett nivåbaserat tillvägagångssätt, som visar totala partiklar, elbilar och elbilar som presenterar vissa proteiner, vilket demonstreras i detta experiment, kan ge en robust lösning på nanopartikelkarakterisering. Detta har varit fallet för projekt som involverar EV-lastning med design för framtida terapeutiska tillämpningar20 och identifiering av CD63 + elbilar med luminal last som mitokondrier38.
nFCM inom repertoaren för EV-analys
En styrka med nFCM EV-analys är hur data kan bekräfta och bygga på de vanligaste EV-analyserna och bilda broar mellan fysiska och fenotypiska datamängder. Detta är dock baserat på exakta märkningsprotokoll som ofta måste optimeras för unika märkningsreagenser som färgämnen och antikroppar. Ett viktigt kriterium för noggrann analys är att ha märkta partiklar suspenderade i en icke-fluorescerande buffert, som bygger på antingen avlägsnande av överskott av obunden fluorofor eller förfining av protokoll för att inte överskrida epitopmättnad.
Jämförelsestudier har visat att nFCM-dimensionering av elbilar ger data i linje med TRPS och kryo-TEM, tekniker som beskrivs som mer exakta än NTA för EV-storleksanalys 10,39. Som med alla optiskt baserade metoder måste dock påverkan av heterogena optiska egenskaper som ses för elbilar och skillnader mellan de optiska egenskaperna hos referensmaterial och elbilar beaktas vid tolkning av data10.
Western blotting har varit en nyckelmetod för att indikera EV-anrikning genom identifiering av EV-markörer40. Men önskan att demonstrera förekomsten av sådana markörer på partiklar har drivit framsteg inom EV-baserade flödescytometriska analyser17. De nödvändiga upplösningarna för att tillhandahålla robusta data uppnås dock för närvarande bäst genom dedikerad instrumentering med avseende på både spritt och fluorescerande ljus19.
nFCM ger ett opartiskt tillvägagångssätt för att initialt beskriva alla partiklar som är irrelevanta för specifika markörer, med hjälp av sidospridningsmätning, vilket möjliggör bekräftelse med de vanligaste teknikerna för NTA, RPS och TEM1, samtidigt som fenotypisk mätning som liknar WB eller Elisa läggs till på ett kvantitativt sätt.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka grupperna Owen Davies och Nick Peake för att de fortsätter att tillhandahålla material och expertis.
APC Anti-CD81 antibody (M38) | abcam | ab233259 | Anti-Human CD81 APC conjugated antibody |
APC Anti-CD9 antibody (EM-04) | Abcam | ab82392 | Anti-mouse CD9 APC conjugated antibody |
APC Anti-CD9 antibody (MEM-61), prediluted | abcam | ab82389 | Anti-Human CD9 APC conjugated antibody |
APC anti-mouse CD63 antibody | biolegend | 143905 | Anti-Mouse CD63 APC conjugated antibody |
APC anti-mouse/rat CD81 antibody | biolegend | 104909 | Anti-Mouse CD81 APC conjugated antibody |
CD63 monoclonal antibody (MEM-259), APC | invitrogen Via Fisherscientific | A15712 | Anti-Human CD63 APC conjugated antibody |
Celline AD1000 bioreactor | Merck | Z688037-5EA | |
Cleaning solution | NanoFCM | 17159 | In house cleaning solution for nanoanalyser |
EVs from C2C12 | Gifted | Mouse line | |
EVs from SW620 | Gifted | Human line | |
Memglow – Fluorogenic Membrane Probe | Cytoskeleton | MG01 | non toxic cell membrane dye |
NanoAnalyzer | NanoFCM | nano-flow cytometer for measurement of single particles | |
PBS, pH 7.2 | Gibco Via Fisherscientific | 12549079 | Salt solution for dilution of samples and antibodies |
Snaplock Microtubes, 0.60mL | Axygen Via Fisherscientific | 11371944 | Tubes required to load sample into nanoanalyser |