Den nyeste generation af EV-karakteriseringsværktøjer er i stand til enkelt EV-analyse på tværs af flere parametre samtidigt. Nano-flowcytometri måler alle biologiske partikler, der er større end 45 nm uden mærkning, og identificerer specifikke egenskaber ved subpopulationer ved hjælp af en række fluorescerende mærkningsteknikker.
Karakterisering af enkeltpartikler er blevet mere og mere relevant for forskning i ekstracellulære vesikler og udvikler sig fra bulkanalyseteknikker og første generations partikelanalyse til omfattende multiparametermålinger såsom nanoflowcytometri (nFCM). nFCM er en form for flowcytometri, der anvender instrumentering specielt designet til nanopartikelanalyse, hvilket gør det muligt at karakterisere tusindvis af elbiler i minuttet både med og uden brug af farvningsteknikker. Påvisning af sidespredning i høj opløsning (SS) gør det muligt at bestemme størrelse og koncentration for alle biologiske partikler, der er større end 45 nm, mens samtidig fluorescens (FL) detektion identificerer tilstedeværelsen af mærkede markører og mål af interesse. Mærkede subpopulationer kan derefter beskrives i kvantitative enheder af partikler / ml eller som en procentdel af de samlede partikler identificeret ved sidespredning.
Her er elbiler afledt af konditionerede cellekulturmedier (CCM) mærket med både et lipidfarvestof for at identificere partikler med en membran og antistoffer, der er specifikke for CD9, CD63 og CD81 som almindelige EV-markører. Målinger af sammenligningsmateriale, en koncentrationsstandard og en størrelsesstandard for silica nanosfærer samt mærket prøvemateriale analyseres i en 1-minuts analyse. Softwaren bruges derefter til at måle koncentrationen og størrelsesfordelingsprofilen for alle partikler, uafhængigt af mærkning, inden man bestemmer de partikler, der er positive for hver af etiketterne.
Samtidig SS- og FL-detektion kan bruges fleksibelt med mange forskellige EV-kilder og mærkningsmål, både eksterne og interne, der beskriver EV-prøver på en omfattende og kvantitativ måde.
Hvad er elbiler?
Ekstracellulære vesikler (EV’er) er den samlede betegnelse for en række celleafledte membranøse partikler, der er integreret i mange normale cellulære og vævsaktiviteter. Deres indvirkning på en lang række videnskabelige områder og deres potentielle kliniske relevans har drevet en vækst i ev-forskning og industriel interesse1. Small EV (sEV) forskning fokuserer primært på exosomer, 40-100 nm partikler, der begynder dannelse i de tidlige endosomer før modning og frigivelse gennem fusion af multi-vesikulære legemer (MVB) til plasmamembranen samt mikrovesikler, som springer direkte fra plasmamembranen, der danner 80-1.000 nm partikler2. En tredje EV-population er apoptotiske kroppe, 50-1.500 nm partikler dannet under celledød, hvilket betyder, at deres relative andel til andre elbiler kan være meget variabel3.
Da EV-egenskaber kan repræsentere ændringer, der forekommer i deres celle / væv af oprindelse, er der potentiale for deres anvendelse i diagnostik. Forskellige ‘omics’ analyser er begyndt at identificere markører for celleoprindelse og sygdomstilstand, hvilket kan muliggøre ikke-invasiv vurdering af patienter ved hjælp af EV-kilder såsom blodplasma / serum, urin, spyt og cerebral spinalvæske (CSF) 4,5. En drivkraft bag disse EV-relaterede innovationer er nye karakteriseringsteknikker, der overvinder tidligere begrænsninger.
Behovet for og udfordringerne ved karakterisering af enkelt-elbiler
Enkelt EV-karakterisering bliver stadig vigtigere for både validering og beskrivelse af EV-isolater samt belysning af nøglefunktioner i disse nanopartikler til progression af EV-baserede terapier og diagnostik6. Afhængigt af EV-kilden og den tilsigtede anvendelse kan analyse af renhed, ofte beskrevet som et forhold mellem EV og ikke-EV-partikler eller som EV til frit protein, kræve betydelige mængder data fra flere analyser7.
Partikeltælling og dimensioneringsmålinger i EV-publikationer har tidligere været stærkt afhængige af Nanopartikelsporing (NTA), resistiv pulsmåling (RPS) og elektronmikroskopi (EM)2. Standard NTA og RPS mangler evnen til at skelne elbiler fra ikke-EV-partikler og har deres egne forbehold såsom langsom gennemstrømning8 og uegnet nedre detektionsgrænse set med NTA 9,10,11.
Tetraspaninerne CD9, CD63 og CD81 har historisk set været vigtige identifikatorer for tilstedeværelsen af elbiler i ev-isolationer/præparater. Almindeligvis bruges western blotting (WB) og dot blotting teknikker til at vise berigelsen af disse proteiner i EV-isolater sammenlignet med cellelysat12. Manglen på kvantificering af disse metoder og heterogeniteten af disse EV-markører, hvad angår både visning inden for EV-subpopulationer og celle-, vævs- eller patientrelateret variation, tilskynder imidlertid til avancerede analytiske teknikker, der forener fysisk og fænotypisk karakterisering13.
Nano-flowcytometri som en omfattende EV-analyseteknik
Bestemmelse af ægte EV-koncentrationer kræver identifikation af intakte partikler og en universel markør, især i komplekse partikelisolater, med opløsning, der er i stand til at detektere alle elbiler, samtidig med at de adskiller dem fra ikke-EV-partikler14.
Nano-flowcytometri (nFCM) er en teknik, der tillader umærket analyse af partikler på størrelse mellem 45-1.000 nm, samtidig med at fluorescerende mærkning og detektion anvendes til at identificere partikelunderpopulationer. En vigtig forskel fra konventionel flowcytometri er brugen af udstyr dedikeret til nanopartikelanalyse, hvilket giver mulighed for den største opløsning15. EV-analyse, der bruger konventionel flowinstrumentering, der er genbrugt til analyse af små partikler, forbedres, men kæmper stadig for at opnå opløsningen til at detektere og analysere <100 nm EVs16,17. Perlebaseret flowcytometri er en yderligere tilpasning, der ofte anvendes til EV-analyse, men dette fjerner muligheden for detektion af enkeltpartikler og introducerer indfangningsbaserede bias18.
Ved at drage fordel af en nedre detektionsgrænse på ~ 45 nm i sidespredningskanalen (SS) til EV-analyse bruger nFCM SS-udløsning. Dette kan betragtes som ‘partikel først’ analyse, da det betyder, at begivenheder skal give et SS-signal, der overskrider en fastsat tærskel før analyse af fluorescensintensiteten. Dette fjerner falske positiver såsom nedbrudte membran- og fluorophoraggregeringer og fokuserer analysen på intakte elbiler15. SS-målinger bruges også til at dimensionere individuelle partikler sammenlignet med en firemodal silica nanosfære standard19. Fluorescensmålingerne foretages på yderligere to detektorer, der gør det muligt at foretage tre samtidige målinger for hver partikel for at beskrive partikelkoncentration, størrelser og tilstedeværelse af markører eller andre mål af interesse for at identificere EV-underpopulationer20.
I det følgende eksperiment bruges SS- og fluorescerende (FL) målinger til at måle >45 nm partikler, vise delmængden af membranpositive elbiler og identificere CD9, CD63, CD81 præsentation på EV-underpopulationer. Både koncentrationen af disse subpopulationer og deres forhold som en del af de samlede partikler målt af SS er beskrevet, ligesom deres størrelsesprofiler.
Oplysninger om prøve og reagens
To EV-isolater fra separate cellelinjer blev udvalgt til demonstration af fluorescerende mærkning og efterfølgende nFCM-analyse. Begge EV-sæt blev suspenderet i PBS og opbevaret ved -80 °C i <3 måneder, men de fleste andre forhold var forskellige mellem isolater. C2C12 musens myoblastcellelinje repræsenterer en embryonal forløber for skeletmuskelceller og blev dyrket i 2D-kultur, der konditionerede vækstmediet over 72 timer før EV-isolering ved ultracentrifugering. SW620 er en human kolon adenocarcinom cellelinje og blev dyrket i en rudimentær bioreaktor, berigende medier over 7 uger, med EV-isolering udført ved størrelsesekskluderingskromatografi (SEC) og fraktioner 7-9 elueret fra sepharose CL-2B kolonner kombineret til en enkelt prøve.
Mens elbiler isoleret og koncentreret fra CCM er de nemmeste prøvetyper at arbejde med, er nFCM anvendelig for de fleste EV-isolater, herunder biofluider som serum, plasma, urin og CSF. Disse prøveanalyser drager fordel af nFCM SS-detektion af alle partikler, hvilket giver mulighed for bekræftelse med NTA, TRPS og andre partikelanalyser, samtidig med at de fluorescerende mærkede EV-subpopulationer beskrives kvantitativt såvel som en andel af det samlede antal for en upartisk tilgang til multiparameterpartikelanalyse. Analyse af lavt forarbejdede prøver er også mulig, såsom uafklaret urin og EV-beriget CCM med det forbehold, at der kræves protein med lavt forurenende stof.
Membranfarvestoffet, der anvendes her, er beregnet til at integrere i lipiddobbeltlaget med en lipofil del til membranbelastning og et hydrofilt farvestof til at forblive i plasmamembranen25. Der er i øjeblikket ikke noget perfekt EV-mærkningsfarvestof, og flere kriterier skal overvejes, når du vælger, herunder specificitet til elbiler, egnethed med fiksering eller permeabilisering og effektivitet af EV-mærkning26.
Fluorescerende konjugeret antistofmærkning af overfladeeksponerede epitoper har vist sig at være en effektiv metode til identifikation af EV-subpopulationer27. Et centralt aspekt af protokoloptimering er at møde og ikke overskride mærkningsmætningspunktet for at binde til alle tilgængelige epitoper uden at hæmme påvisning af partikler med lav fluorescens ved at lade den omgivende buffer fyldes med fluorescerende ubundet antistof28. Derudover er tilgængeligheden af eksponerede bindingssteder til antistofmærkning potentielt påvirket af flere faktorer. Opbevaringsforhold for elbiler har vist sig at påvirke koncentrations- og størrelsesprofiler for elbiler29 med observationer, der også indikerer virkninger på antistofmærkning30. Tilstedeværelsen af overfladekoronaproteiner, proteinmodifikationer og virkninger af isolationsteknikker kan også have virkninger på antistofmærkning i nogle tilfælde. I sidste ende, efterhånden som brugen af fluorescerende mærkning bliver mere udbredt til EV-undersøgelser, vil eksperimentelt design og optimering til flere analytiske teknikker blive mere raffineret.
For at øge nøjagtigheden af resultaterne kan flere kontroller inkluderes, såsom (1) PBS + farvestofkontrol, for at vurdere micelle eller aggregeret dannelse i nogle farvestoffer, som kan forekomme som SS + partikler i nFCM-analyse, (2) PBS + antistofkontrol, aggregater kan forekomme, selvom de ofte ikke er store nok til at sprede nok lys til SS-detektion, (3) EV-prøve + IgG-antistofkontrol, almindelig i flowcytometri og bruges til at identificere enhver ikke-specifik binding, (4) ikke-EV-partikelprøve + antistof/ farvestofkontrol – især vigtigt, når man skal identificere EV’er i komplekse partikelprøver, kontroller såsom oprensede LDL-partikler (low-density lipoprotein) eller EV-udtømte / ablated prøver kan fungere som en negativ kontrol for at validere selektiv mærkning, (5) positive kontroller er svære at designe, men validering af et antistof på celler er en nyttig inklusion.
Præsentation af tetraspaniner på elbiler
Antistof- og membranmærkningen af dette eksperiment viser det høje niveau af kvantitative data, der kan opnås inden for en lille tidsramme ved nFCM-analyse. Samtidig måling af de vigtigste fysiske egenskaber ved partikeldiameter/koncentration med de fænotypiske målinger af membran- og/eller proteintilstedeværelse fører til beskrivelser på højt niveau af subpopulationer inden for partikelisolering.
Det er vigtigt, at forskellige niveauer af de tre ‘nøgle’ EV-relaterede tetraspaniner, CD9, CD63, CD81, blev identificeret i disse to EV-prøver. CD9 blev præsenteret på den største andel af elbiler til både C2C12-afledte elbiler og SW620, hvor CD81 og CD63 var henholdsvis det andet og mindst præsenterede protein.
På trods af nogle ligheder, der er observeret her i tetraspaninprofilerne for elbiler fra to meget forskellige cellekilder, kan niveauer af CD9, CD63 og CD81 være meget forskellige mellem cellelinje og patientafledte elbiler31.
Forskellen i CD63-ekspression mellem de to EV-prøver er særlig relevant for den igangværende diskussion af nøgleidentifikatorer for ‘EV-ness’. Mens præsentation af CD63 i kun ~ 8% af SW620-elbilerne kan være uventet af nogle, er CD63 blevet foreslået som dårlig identifikator for de forskellige typer elbiler isoleret efter størrelse eller tæthed32, og tetraspaninnegative elbiler er blevet identificeret, selv når de beskrives som exosomlignende33.
Identifikation af elbiler inden for komplekse partikelisoleringer
Heterogeniteten af EV-tetraspaninprofiler, både i cellelinje- og patientafledte elbiler, advarer mod afhængighed af tetraspaninbaseret indfangning af elbiler og fremhæver det fremtidige behov for nye EV-identifikationsmetoder31. EV-mærkning uafhængig af specifikke proteiner kan vise sig at være yderst gavnlig for at identificere elbiler fra lignende størrelse ikke-EV-partikler, hvis EV-specificitet kan bevises at være meget høj. Dette gælder især for biofluid EV-isolater, da det er blevet foreslået, at koncentrationen af elektriske køretøjer i humant blodplasma ligger i området 10 10 partikler / ml, mens lipoproteiner måles ved10 16 pr. ml 14,34. Selv ved EV-berigelse antyder undersøgelser, der sammenligner partikelpositivitet for tetraspaninmarkører og / eller LDL-markør ApoB, ~ 50-100x større overflod af LDL i blodpladefri plasma (PFP) prøver sammenlignet med EV35.
Den anvendte isolationsteknik påvirker i høj grad rækkevidden af co-isolerede ikke-EV-partikler, såsom lipoproteiner med meget lav densitet (VLDL), lipoproteiner med mellemdensitet (IDL) og LDL36. Der er også beskrivelser af lipoprotein-co-isolater bundet til elbiler, som, selvom de potentielt spiller en vigtig biologisk rolle, gør opnåelse af EV-rene prøver til et udfordrende mål35.
Derfor kan man argumentere for, at der lægges større vægt på beskrivelsen af partikler, der udgør en prøve, frem for at opnå isolering af et rent, men begrænset udvalg af elbiler. At opnå en omfattende beskrivelse af partikler ved at måle tetraspaninforekomsten i bulk- og partikeltællinger separat kan være utilstrækkeligt til nøjagtigt at bestemme EV-koncentrationer, især fra biofluidkilder36,37. Identifikation af subpopulationer i en niveaubaseret tilgang, der viser samlede partikler, EV’er og EV’er, der præsenterer visse proteiner, som demonstreret i dette eksperiment, kan give en robust løsning på nanopartikelkarakterisering. Dette har været tilfældet for projekter, der involverer EV-lastning med design til fremtidige terapeutiske anvendelser20 og identifikation af CD63+ elbiler med luminal last såsom mitokondrier38.
nFCM inden for repertoiret af EV-analyser
En styrke ved nFCM EV-analyse er den måde, hvorpå data kan bekræfte og bygge videre på de mest almindelige EV-analyser og danne broer mellem fysiske og fænotypiske datasæt. Dette er dog baseret på nøjagtige mærkningsprotokoller, som ofte skal optimeres til unikke mærkningsreagenser såsom farvestoffer og antistoffer. Et nøglekriterium for nøjagtig analyse er at have mærket partikler suspenderet i en ikke-fluorescerende buffer, som er afhængig af enten fjernelse af overskydende ubundet fluorophore eller forfining af protokoller for ikke at overskride epitopmætning.
Sammenligningsundersøgelser har vist, at nFCM-dimensionering af elbiler giver data i overensstemmelse med TRPS og cryo-TEM, teknikker, der beskrives som mere nøjagtige end NTA til EV-størrelsesanalyse10,39. Som med enhver optisk baseret metode skal indflydelsen af heterogene optiske egenskaber, der ses for elbiler, og forskelle mellem referencematerialets og elbilernes optiske egenskaber imidlertid anerkendes ved fortolkningen af data10.
Western blotting har været en vigtig metode til at indikere EV-berigelse gennem identifikation af EV-markører40. Men ønsket om at demonstrere tilstedeværelsen af sådanne markører på partikler har drevet fremskridt inden for EV-baserede flowcytometriske analyser17. De nødvendige beslutninger til at tilvejebringe robuste data opnås dog i øjeblikket bedst gennem dedikeret instrumentering med hensyn til både spredt og fluorescerende lys19.
nFCM giver en upartisk tilgang til indledningsvis at beskrive alle partikler, der er irrelevante for specifikke markører, ved hjælp af sidespredningsmåling, hvilket giver mulighed for bekræftelse med de mest almindelige teknikker i NTA, RPS og TEM1, samtidig med at der tilføjes fænotypisk måling svarende til WB eller Elisa på en kvantitativ måde.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke grupperne Owen Davies og Nick Peake for fortsat at levere materiale og ekspertise.
APC Anti-CD81 antibody (M38) | abcam | ab233259 | Anti-Human CD81 APC conjugated antibody |
APC Anti-CD9 antibody (EM-04) | Abcam | ab82392 | Anti-mouse CD9 APC conjugated antibody |
APC Anti-CD9 antibody (MEM-61), prediluted | abcam | ab82389 | Anti-Human CD9 APC conjugated antibody |
APC anti-mouse CD63 antibody | biolegend | 143905 | Anti-Mouse CD63 APC conjugated antibody |
APC anti-mouse/rat CD81 antibody | biolegend | 104909 | Anti-Mouse CD81 APC conjugated antibody |
CD63 monoclonal antibody (MEM-259), APC | invitrogen Via Fisherscientific | A15712 | Anti-Human CD63 APC conjugated antibody |
Celline AD1000 bioreactor | Merck | Z688037-5EA | |
Cleaning solution | NanoFCM | 17159 | In house cleaning solution for nanoanalyser |
EVs from C2C12 | Gifted | Mouse line | |
EVs from SW620 | Gifted | Human line | |
Memglow – Fluorogenic Membrane Probe | Cytoskeleton | MG01 | non toxic cell membrane dye |
NanoAnalyzer | NanoFCM | nano-flow cytometer for measurement of single particles | |
PBS, pH 7.2 | Gibco Via Fisherscientific | 12549079 | Salt solution for dilution of samples and antibodies |
Snaplock Microtubes, 0.60mL | Axygen Via Fisherscientific | 11371944 | Tubes required to load sample into nanoanalyser |