استخدام بيانات الدودة المفردة لقياس عدم التجانس في التفاعلات البكتيرية Caenorhabditis elegans
Summary
يصف هذا البروتوكول اضطرابا في 96 بئرا من Caenorhabditis elegans المستعمر بكتيريا فرديا بعد الشلل البارد وتبييض السطح لإزالة البكتيريا الخارجية. يتم طلاء التعليق الناتج على ألواح أجار للسماح بتحديد كمي دقيق ومتوسط الإنتاجية للحمل البكتيري في أعداد كبيرة من الديدان الفردية.
Abstract
الديدان الخيطية Caenorhabditis elegans هو نظام نموذجي للتفاعلات بين الميكروب المضيف والميكروبيوم المضيف. تستخدم العديد من الدراسات حتى الآن هضمات الدفعات بدلا من عينات الدودة الفردية لتحديد الحمل البكتيري في هذا الكائن الحي. هنا يقال إن التباين الكبير بين الأفراد الذي شوهد في الاستعمار البكتيري لأمعاء C. elegans مفيد ، وأن طرق هضم الدفعات تتجاهل المعلومات المهمة للمقارنة الدقيقة عبر الظروف. نظرا لأن وصف التباين المتأصل في هذه العينات يتطلب أعدادا كبيرة من الأفراد ، فقد تم إنشاء بروتوكول مناسب للوحة 96 بئرا للتعطيل وطلاء المستعمرة للديدان الفردية.
Introduction
ويلاحظ عدم التجانس في ارتباطات الميكروبات المضيفة في كل مكان، ويتزايد الاعتراف بالتباين بين الأفراد كعامل مساهم في العمليات على مستوى السكان من المنافسة والتعايش1 إلى انتقال الأمراض2،3،4. في C. elegans ، لوحظ “عدم التجانس الخفي” داخل المجموعات السكانية متساوية المنشأ مرارا وتكرارا ، حيث أظهرت المجموعات الفرعية للأفراد أنماطا ظاهرية متميزة في استجابة الصدمة الحرارية5,6 ، والشيخوخة ، والعمر 7,8,9,10,11 ، والعديد من الجوانب الأخرى لعلم وظائف الأعضاء والتنمية 12 . توفر معظم التحليلات التي تحاول تحديد بنية السكان الفرعية أدلة على مجموعتين فرعيتين في المجموعات التجريبية للديدان المتزامنة متساوية المنشأ 5,7,8 ، على الرغم من أن البيانات الأخرى تشير إلى إمكانية توزيع السمات داخل السكان بدلا من المجموعات المتميزة 7,12,13 . ومما له أهمية هنا ، لوحظ عدم تجانس كبير في المجموعات المعوية حتى داخل مجموعات متساوية المنشأ من الديدان المستعمرة من مصدر مشترك للميكروبات 13،14،15،16 ، ويمكن إخفاء هذا عدم التجانس من خلال قياسات هضم الدفعات التي تستخدم على نطاق واسع17،18،19،20 للقياس الكمي البكتيري في الدودة.
يقدم هذا العمل بيانات تشير إلى الحاجة إلى مزيد من الاعتماد على قياسات الدودة الواحدة في ارتباط الميكروب المضيف ، بالإضافة إلى بروتوكولات لزيادة الدقة والإنتاجية في اضطراب الدودة الواحدة. تم تصميم هذه البروتوكولات لتسهيل التعطيل الميكانيكي لأعداد كبيرة من C. elegans الفردية لتحديد كمية الحمل البكتيري القابل للحياة ، مع توفير قابلية تكرار أفضل وجهد أقل لكل عينة من التعطيل القائم على المدقة للديدان الفردية. يتم تضمين خطوة تطهير الأمعاء الموصى بها ، حيث يسمح للديدان بالتغذية على الإشريكية القولونية المقتولة بالحرارة قبل التحضير للاضطراب ، لتقليل المساهمات من البكتيريا التي تم تناولها مؤخرا وغيرها من البكتيريا العابرة (غير الملتزمة). وتشمل هذه البروتوكولات طريقة الشلل البارد لتنظيف البشرة باستخدام معالجة التبييض السطحي منخفض التركيز. يمكن استخدام التبييض السطحي كخطوة تحضيرية في اضطراب الدودة الواحدة أو كوسيلة لإعداد الديدان الحية الخالية من الجراثيم خارجيا. طريقة تبييض السطح هذه كافية لإزالة مجموعة واسعة من الميكروبات الخارجية ، وتوفر المعالجة الباردة بديلا للشلل التقليدي القائم على الليفاميزول. في حين أن الليفاميزول سيكون مفضلا للتجارب الحساسة للبرد ، فإن الشلل البارد يقلل من المساهمات في تيارات النفايات الخطرة ويسمح بالاستئناف السريع للنشاط الطبيعي. في حين أن البروتوكول الكامل يصف تجربة معملية حيث يتم استعمار الديدان بالبكتيريا المعروفة ، يمكن بسهولة تطبيق إجراءات تنظيف الديدان واضطراب الدودة الواحدة على الديدان المعزولة من العينات البرية أو المستعمرة في تجارب العالم المصغر. تنتج البروتوكولات الموصوفة هنا بكتيريا حية مستخرجة من أمعاء الدودة ، مناسبة للطلاء والقياس الكمي لوحدات تشكيل المستعمرة (CFUs) في الديدان الفردية ؛ لتحليل المجتمع المعوي القائم على التسلسل ، يجب إضافة خطوات تحلل الخلايا اللاحقة واستخراج الحمض النووي إلى هذه البروتوكولات.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا يتم تقديم البيانات حول مزايا القياس الكمي للدودة المفردة للحمل البكتيري في C. elegans ، إلى جانب بروتوكول تعطيل 96 بئرا للسماح بالحصول السريع والمتسق على مجموعات البيانات الكبيرة من هذا النوع. بالمقارنة مع الطرق الحالية33 ، تسمح هذه البروتوكولات بقياس إنتاجية أعلى للمجتم?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن يعربوا عن تقديرهم ل H. Schulenberg و C. LaRock لمشاركتهم السخية للسلالات البكتيرية المستخدمة في هذه التجارب. تم دعم هذا العمل بتمويل من جامعة إيموري و NSF (PHY2014173).
Materials
| 96-well flat-bottom polypropylene plates, 300 uL | Evergreen Labware | 290-8350-03F | |
| 96-well plate sealing mat, silicon, square wells (AxyMat) | Axygen | AM-2ML-SQ | |
| 96-well plates, 2 mL, square wells | Axygen | P-2ML-SQ-C-S | |
| 96-well polypropylene plate lids | Evergreen Labware | 290-8020-03L | |
| Agar | Fisher Scientific | 443570050 | |
| Bead mill adapter set for 96-well plates | QIAGEN | 119900 | Adapter plates for use with two 96-well plates on the TissueLyser II |
| Bead mill tissue homogenizer (TissueLyser II) | QIAGEN | 85300 | Mechanical homogenizer for medium to high-throughput sample disruption |
| BioSorter | Union Biometrica | By quotation | Large object sorter equipped with a 250 micron focus for C. elegans |
| Bleach, commercial, 8.25% sodium hypochlorite | Clorox | ||
| Breathe-Easy 96-well gas permeable sealing membrane | Diversified Biotech | BEM-1 | Multiwell plate gas permeable polyurethane membranes. Thin sealing film is permeable to O2, CO2, and water vapors and is UV transparent down to 300 nm. Sterile, 100/box. |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | AC423525000 | |
| Cholesterol | VWR | AAA11470-30 | |
| Citric acid monohydrate | Fisher Scientific | AC124910010 | |
| Copper (II) sulfate pentahydrate | Fisher Scientific | AC197722500 | |
| Corning 6765 LSE Mini Microcentrifuge | Corning | COR-6765 | |
| Disodium EDTA | Fisher Scientific | 409971000 | |
| DL 1,4 Dithiothreitol, 99+%, for mol biology, DNAse, RNAse and Protease free, ACROS Organics | Fisher Scientific | 327190010 | |
| Eppendorf 1.5 mL microcentrifuge tubes, natural | Eppendorf | ||
| Eppendorf 5424R microcentrifuge | Eppendorf | 5406000640 | 24-place refrigerated benchtop microcentrifuge |
| Eppendorf 5810R centrifuge with rotor S-4-104 | Eppendorf | 22627040 | 3L benchtop centrifuge with adaptors for 15-50 mL tubes and plates |
| Eppendorf plate bucket (x2), for Rotor S-4-104 | Eppendorf | 22638930 | |
| Ethanol 100% | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Glass beads, 2.7 mm | Life Science Products | LS-79127 | |
| Glass beads, acid-washed, 425-600 µm | Sigma | G877-500G | |
| Glass plating beads | VWR | 76005-124 | |
| Hydrochloric acid | VWR | BDH7204-1 | |
| Iron (II) sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | 423731000 | |
| Kimble Kontes pellet pestle motor | DWK Life Sciences | 749540-0000 | |
| Kimble Kontes polypropylene pellet pestles and microtubes, 0.5 mL | DWK Life Sciences | 749520-0590 | |
| Leica DMi8 motorized inverted microscope with motorized stage | Leica | 11889113 | |
| Leica LAS X Premium software | Leica | 11640687 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | AC124900010 | |
| Manganese(II) chloride tetrahydrate | VWR | 470301-706 | |
| PARAFILM M flexible laboratory sealing film | Amcor | PM996 | |
| Peptone | Fisher Scientific | BP1420-500 | |
| Petri dishes, round, 10 cm | VWR | 25384-094 | |
| Petri dishes, round, 6 cm | VWR | 25384-092 | |
| Petri dishes, square, 10 x 10 cm | VWR | 10799-140 | |
| Phospho-buffered saline (1X PBS) | Gold Bio | P-271-200 | |
| Polypropylene autoclave tray, shallow | Fisher Scientific | 13-361-10 | |
| Potassium hydroxide | Fisher Scientific | AC134062500 | |
| Potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-1 | |
| R 4.1.3/RStudio 2022.02.0 build 443 | R Foundation | n/a | |
| Scoop-type laboratory spatula, metal | VWR | 470149-438 | |
| Silicon carbide 36 grit | MJR Tumblers | n/a | Black extra coarse silicon carbide grit. Available in 0.5-5 lb sizes from this vendor. |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher Scientific | BP166-100 | |
| Sodium hydroxide | VWR | BDH7247-1 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Sodum chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | AC419760010 | |
| Tri-potassium citrate monohydrate | Fisher Scientific | AC611755000 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | AC205982500 |
References
- Armitage, D. W., Jones, S. E. How sample heterogeneity can obscure the signal of microbial interactions. The ISME Journal. 13 (11), 2639-2646 (2019).
- Stephenson, J., et al. Host heterogeneity affects both parasite transmission to and fitness on subsequent hosts. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 372 (1719), 20160093 (2017).
- VanderWaal, K. L., Ezenwa, V. O. Heterogeneity in pathogen transmission: mechanisms and methodology. Functional Ecology. 30 (10), 1606-1622 (2016).
- Dwyer, G., Elkinton, J. S., Buonaccorsi, J. P. Host heterogeneity in susceptibility and disease dynamics: tests of a mathematical model. The American Naturalist. 150 (6), 685-707 (1997).
- Wu, D., Rea, S. L., Yashin, A. I., Johnson, T. E. Visualizing hidden heterogeneity in isogenic populations of C. elegans. Experimental Gerontology. 41 (3), 261-270 (2006).
- Yashin, A. I., et al. Heat shock changes the heterogeneity distribution in populations of Caenorhabditis elegans does it tell us anything about the biological mechanism of stress response. The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 57 (3), 83-92 (2002).
- Zhao, Y., et al. Two forms of death in ageing Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 8 (1), 1-8 (2017).
- Eckley, D. M., et al. Molecular characterization of the transition to mid-life in Caenorhabditis elegans. AGE. 35 (3), 689-703 (2012).
- Rea, S. L., Wu, D., Cypser, J. R., Vaupel, J. W., Johnson, T. E. A stress-sensitive reporter predicts longevity in isogenic populations of Caenorhabditis elegans. Nature Genetics. 37 (8), 894-898 (2005).
- Kinser, H. E., Mosley, M. C., Plutzer, I. B., Pincus, Z. Global, cell non-autonomous gene regulation drives individual lifespan among isogenic C. elegans. eLife. , (2021).
- Churgin, M. A., et al. Longitudinal imaging of Caenorhabditis elegans in a microfabricated device reveals variation in behavioral decline during aging. eLife. 6, 26652 (2017).
- Perez, M. F., Francesconi, M., Hidalgo-Carcedo, C., Lehner, B. Maternal age generates phenotypic variation in Caenorhabditis elegans. Nature. 552 (7683), 106-109 (2017).
- Baeriswyl, S., et al. Modulation of aging profiles in isogenic populations of Caenorhabditis elegans by bacteria causing different extrinsic mortality rates. Biogerontology. 11 (1), 53 (2009).
- Taylor, M., Vega, N. M. Host immunity alters community ecology and stability of the microbiome in a Caenorhabditis elegans model. mSystems. 6 (2), 00608-00620 (2021).
- Diaz, S. A., Restif, O. Spread and transmission of bacterial pathogens in experimental populations of the nematode Caenorhabditis elegans. Applied and Environmental Microbiology. 80 (17), 5411-5418 (2014).
- Twumasi-Boateng, K., Berg, M., Shapira, M. Automated separation of C. elegans variably colonized by a bacterial pathogen. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (85), e51090 (2014).
- Ortiz, A., Vega, N. M., Ratzke, C., Gore, J. Interspecies bacterial competition regulates community assembly in the C. elegans intestine. The ISME Journal. 15 (7), 2131-2145 (2021).
- Berg, M., et al. TGFβ/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals. Nature Communications. 10 (1), 604 (2019).
- Portal-Celhay, C., Blaser, M. J. Competition and resilience between founder and introduced bacteria in the Caenorhabditis elegans gut. Infection and Immunity. 80 (3), 1288-1299 (2012).
- Scott, E., Holden-Dye, L., O’Connor, V., Wand, M. E. Intra strain variation of the effects of gram-negative ESKAPE pathogens on intestinal colonization, host viability, and host response in the model organism Caenorhabditis elegans. Frontiers in Microbiology. 10, 3113 (2020).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biology. 2 (1), (2001).
- Dirksen, P., et al. The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model. BMC Biology. 14, 38 (2016).
- Vega, N. M., Allison, K. R., Samuels, A. N., Klempner, M. S., Collins, J. J. Salmonella typhimurium intercepts Escherichia coli signaling to enhance antibiotic tolerance. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (35), 14420-14425 (2013).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
- Tabara, H., et al. The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans. Cell. 99 (2), 123-132 (1999).
- Ahringer, J. Reverse genetics. WormBook. , (2006).
- Rual, J. -. F., et al. Toward improving Caenorhabditis elegans phenome mapping with an ORFeome-based RNAi library. Genome Research. 14 (10), 2162-2168 (2004).
- Revtovich, A. V., et al. Development and characterization of high-throughput Caenorhabditis elegans – Enterococcus faecium infection model. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 667327 (2021).
- Anderson, Q. L., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. A high-throughput, high-content, liquid-based C. elegans pathosystem. JoVE (Journal of Visualized Experiments. (137), e58068 (2018).
- Scholz, M., Dinner, A. R., Levine, E., Biron, D. Stochastic feeding dynamics arise from the need for information and energy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (35), 9261-9266 (2017).
- Wu, T., et al. Pheromones modulate learning by regulating the balanced signals of two insulin-like peptides. Neuron. 104 (6), 1095-1109 (2019).
- Ching, T. -. T., Hsu, A. -. L. Solid plate-based dietary restriction in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (51), e2701 (2011).
- Walker, A. C., Bhargava, R., Vaziriyan-Sani, A. S., Brust, A. S., Czyz, D. M. Quantification of bacterial loads in Caenorhabditis elegans. Bio-protocol. 12 (2), 4291-4291 (2022).
- Manjarrez, J. R., Mailler, R. Stress and timing associated with Caenorhabditis elegans immobilization methods. Heliyon. 6 (7), 04263 (2020).
- Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PLoS ONE. 6 (4), 0019505 (2011).
- Garsin, D. A., et al. Long-lived C. elegans daf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens. Science. 300 (5627), 1921 (2003).
- Thutupalli, S., et al. Farming and public goods production in Caenorhabditis elegans populations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (9), 2289-2294 (2017).
- Ly, K., Reid, S. J., Snell, R. G. Rapid RNA analysis of individual Caenorhabditis elegans. MethodsX. 2, 59-63 (2015).
- Johnke, J., Dirksen, P., Schulenburg, H. Community assembly of the native C. elegans microbiome is influenced by time, substrate, and individual bacterial taxa. Environmental Microbiology. 22 (4), 1265-1279 (2020).
- Vega, N. M., Gore, J. Stochastic assembly produces heterogeneous communities in the Caenorhabditis elegans intestine. PLOS Biology. 15 (3), 2000633 (2017).
- Gulyas, L., Powell, J. R. Cold shock induces a terminal investment reproductive response in C. elegans. Scientific Reports. 12 (1), 1338 (2022).
- Jiang, W., et al. A genetic program mediates cold-warming response and promotes stress-induced phenoptosis in C. elegans. eLife. 7, 35037 (2018).
- Robinson, J. D., Powell, J. R. Long-term recovery from acute cold shock in Caenorhabditis elegans. BMC Cell Biology. 17 (1), 2 (2016).
